熒光分光光度法測定藥液維生素B2的含量

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1、熒光分光光度法測定藥液維生素B2的含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)熒光分光光度法測定藥液中維生素B2的分析原理。掌握熒光分光光度計(jì)的操作技術(shù)和測定藥液中維生素B2的方法。實(shí)驗(yàn)原理熒光分析法常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度IF與物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系：當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系：這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。a.與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有

2、更高的靈敏度。b.選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來鑒定物質(zhì)。c.所需試樣量少、操作方法簡便。熒光分析法的特點(diǎn)激發(fā)光譜：固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大。發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。固定發(fā)射光波長進(jìn)行激發(fā)光波長掃描，找出最大激發(fā)光波長，然后固定激發(fā)光波長進(jìn)行熒光發(fā)射波長掃描，找出最大熒光發(fā)射波長。激發(fā)光波長和發(fā)射熒光波長的選擇是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。熒光光譜激發(fā)光譜

3、發(fā)射光譜熒光分析儀器常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測器和顯示記錄器五部分構(gòu)成，如下圖所示：熒光分析儀器與分光光度計(jì)比較主要差別有兩點(diǎn)：a.熒光分析儀器采用垂直測量方式，以消除透射光的影響；b.熒光分析儀器有兩個(gè)單色器，能夠獲得單色性較好的激發(fā)光并消除其它雜散光干擾。液槽顯示器單色器檢測器I0IIf光源單色器a.光源：在熒光計(jì)中常用鹵鎢燈作光源；熒光分度計(jì)常采用高壓汞燈或氙弧燈做光源。b.單色器：熒光計(jì)的單色器是濾光片，只能用于定量分析；熒光分光光度計(jì)采用兩個(gè)光柵單色器，可獲得激發(fā)光譜和熒光光譜。c.檢測器：熒光計(jì)采

4、用光電管作檢測器；熒光分光光度計(jì)采用光電倍增管作檢測器。儀器部件維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。藥液維生素B2含量的測定維生素B2溶液在430～440nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，其峰值波長為525nm。VB2的熒光在pH=6～7時(shí)最強(qiáng)，在pH=11時(shí)消失。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測VB2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行

5、。光黃素實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)預(yù)習(xí)熒光分光光度法測定維生素B2的分析原理。了解熒光光度計(jì)的操作步驟和測定維生素B2的方法。F96型熒光光度計(jì)（上海棱光分析儀器有限公司）5mL吸量管1只，2mL吸量管1只，50mL容量瓶7只10.0μg·mL-1VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液（置陰暗處保存），冰乙酸（AR），藥用VB2試樣儀器與試劑1.打開氙燈，再打開主機(jī)，然后打開計(jì)算機(jī)啟動(dòng)工作站并初始化儀器。2.儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項(xiàng)目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：激發(fā)波長=440nm（本儀器只有356nm），發(fā)射波長=540nm。3.樣品測定。4.退出主程序，關(guān)閉

6、計(jì)算機(jī)，先關(guān)主機(jī)，最后關(guān)氙燈?；静僮?.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測定：在六個(gè)干凈的50mL容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50，2.00、2.50和3.00mLVB2標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入2.00mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。從稀到濃測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。2.未知試樣的測定:移取0.1mL試樣,用少量水溶解后轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，加2.00mL冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標(biāo)準(zhǔn)系列時(shí)相同的條件，測量其熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)步驟1.用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。2.根據(jù)待測液的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

7、上求得其濃度，計(jì)算出試樣中VB2含量。數(shù)據(jù)處理1.解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因。2.維生素B2在pH＝6～7時(shí)熒光最強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)為何在酸性溶液中測定？注意事項(xiàng)和問題