熒光分光光度法測(cè)定多維葡萄糖粉中維生素b2的含量

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1、熒光分光光度法測(cè)定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量姓名：周蘊(yùn)赟學(xué)號(hào)：40507026（2005級(jí)4班Email:zyy1021@stu.snnu.edu.cn）?一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)熒光分光光度法測(cè)定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理；2、掌握熒光分光光度計(jì)的操作技術(shù)和測(cè)定多維葡萄糖粉中維生素B2的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過(guò)無(wú)輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長(zhǎng)長(zhǎng)的光而產(chǎn)生熒光。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度IF與物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系：當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)

2、度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系：這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。熒光分析法的特點(diǎn)：a.與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度。b.選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來(lái)鑒定物質(zhì)。c.所需試樣量少、操作方法簡(jiǎn)便。熒光光譜激發(fā)光譜：固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng))，化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與照射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大。發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線。固定發(fā)射光波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)光波長(zhǎng)掃描，找出最大激發(fā)光波長(zhǎng)，然后固定激發(fā)光波長(zhǎng)進(jìn)行熒光發(fā)射波長(zhǎng)掃描，找出

3、最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)。激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射熒光波長(zhǎng)的選擇是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。熒光分析儀器常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和顯示記錄器五部分構(gòu)成，如下圖所示：液槽顯示器單色器檢測(cè)器I0IIf光源單色器維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無(wú)臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430～440nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535nm。維生素B2在pH=6～7的溶液中熒光強(qiáng)度最大，在pH=11的堿性溶液中熒光消失，所以可以用熒光光度法測(cè)維生素B2的含量。多維葡萄糖中

4、含有維生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光，維生素B1本身無(wú)熒光，在堿性溶液中用鐵氰化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光，維生素D2用二氯乙酸處理后才有熒光，他們都不干擾維生素B2的測(cè)定。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測(cè)維生素B2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。三、試劑與儀器:970CRT熒光光度計(jì)5ml吸量管1只，2ml吸量管1只，50ml容量瓶6只,100ml容量瓶1只10.0μg/ml維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰乙酸，多維葡萄糖粉試樣。四、實(shí)驗(yàn)步驟:（一）、970C

5、RT熒光光度計(jì)基本操作：1.打開氙燈，再打開主機(jī)，然后打開計(jì)算機(jī)啟動(dòng)工作站并初始化儀器，預(yù)熱30min。2.儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為440nm，發(fā)射波長(zhǎng)為540nm，靈敏度＝2，入射縫寬和出射縫寬均為10nm。3、點(diǎn)擊“測(cè)本底值”，測(cè)得本底值為1.41。4.樣品測(cè)定1）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測(cè)定：???在6個(gè)干凈的50ml容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入2.00ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。得到不同濃度的溶液分別是：0.1，0.2

6、，0.3，0.5，0.6ug/ml的維生素B2溶液，從稀到濃測(cè)量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。2）未知試樣的測(cè)定：稱取0.1378g多維葡萄糖粉試樣,用少量水溶解后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，加2.00ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列時(shí)相同的條件，平行測(cè)量其熒光強(qiáng)度3次。5、退出主程序，關(guān)閉計(jì)算機(jī)，先關(guān)主機(jī)，最后關(guān)氙燈。五、數(shù)據(jù)處理：1.用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度(μg/ml)熒光強(qiáng)度(I)123平均0.14.3234.3074.2984.3090.27.3807.3297.3407.3500.39.8409.8019.7909.8100.412.

7、02012.03311.97612.0100.514.67814.78114.74414.7340.617.08817.09117.09017.0902、未知樣品濃度的測(cè)定????????????????根據(jù)待測(cè)液的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度，計(jì)算出試樣中含量。編號(hào)123平均值I7.1777.2027.1277.177C/ug.ml-10.2030.2040.2010.203維生素B2百分含量=(0.203×50×10-6)/0.1378×100％=0.0074％六、注意事項(xiàng)1.使用970CRT時(shí)，要按照儀器使用規(guī)定使用，不可隨意操作。2.