熒光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素b2的含量

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1、熒光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理；2、掌握熒光分光光度計的操作技術(shù)和測定多維葡萄糖粉中維生素B2的方法。實驗原理光源→單色器→吸收池↓If=2.303φI0εbc單色器↓檢測器維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430～440nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535nm。維生素B2在pH=6～7的溶

2、液中熒光強(qiáng)度最大，在pH=11的堿性溶液中熒光消失，所以可以用熒光光度法測維生素B2的含量。多維葡萄糖中含有維生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光，維生素B1本身無熒光，在堿性溶液中用鐵氰化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光，維生素D2用二氯乙酸處理后才有熒光，他們都不干擾維生素B2的測定。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測維生素B2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。試劑與儀器970CRT熒光光度計5ml吸量管1只，2

3、ml吸量管1只，50ml容量瓶6只,100ml容量瓶1只10.0μg/ml維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰乙酸，多維葡萄糖粉試樣.實驗步驟（一）、970CRT熒光光度計基本操作：1.打開氙燈，再打開主機(jī)，然后打開計算機(jī)啟動工作站并初始化儀器，預(yù)熱30min2.儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：設(shè)置激發(fā)波長為440nm，發(fā)射波長為540nm，靈敏度＝2，入射縫寬和出射縫寬均為10nm。3.樣品測定1）、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測定：???在6個干凈的50ml容量瓶中，分別吸取0.50、

4、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入2.00ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。得到不同濃度的溶液分別是：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ug/ml的維生素B2溶液，從稀到濃測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。2）、未知試樣的測定:稱取0.7481g多維葡萄糖粉試樣,用少量水溶解后轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，加2.00ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標(biāo)準(zhǔn)系列時相同的條件，平行測量其熒光強(qiáng)度3次4、退出主程序，關(guān)閉計算機(jī)，先關(guān)主機(jī)，最后關(guān)氙燈。數(shù)據(jù)處理1.用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度繪制

5、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。熒光強(qiáng)度(I)濃度(μg/ml)123平均值3.36703.38803.42503.39330.18.45508.49208.48608.47760.213.349013.439013.488013.42530.318.563018.641018.691018.63160.423.440023.438023.485023.45430.528.240028.305028.419028.32130.6?2、未知樣品濃度的測定根據(jù)待測液的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度，計算出試樣中含量。編號123平均值

6、If25.43025.57725.55125.519C/ug.ml-10.5400.5430.5420.542???維生素B2百分含量=（0.542*50.00）/(0.7481*106)*100%=0.00362%注意事項1.使用970CRT時，要按照儀器使用規(guī)定使用，不可隨意操作2.使用石英比色皿時，要注意勿用手直接觸摸比色皿表面，因握住棱。思考題1.試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因?答：熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度，可成倍提高熒光強(qiáng)度。同時，提高儀器靈敏度，也可提高熒光光度法的靈敏度。而

7、對于吸收光度法，無論是提高激發(fā)光強(qiáng)度提高儀器靈敏度還是提高儀器靈敏度，入射光和出射光同時增大，其靈敏度不變。因此，熒光光度法較吸收光度法靈敏度高2.維生素B2在pH＝6～7時熒光最強(qiáng)，本實驗為何在酸性溶液中測定？答：因為維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射，會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，后者的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多。因此，測量時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且必須在避光條件下進(jìn)行。