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《熒光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素b2的含量》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、熒光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理;2、掌握熒光分光光度計的操作技術(shù)和測定多維葡萄糖粉中維生素B2的方法。實驗原理光源→單色器→吸收池↓If=2.303φI0εbc單色器↓檢測器維生素B2(又叫核黃素,VB2)是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶,其結(jié)構(gòu)式為:維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑,在中性或酸性溶液中穩(wěn)定,光照易分解,對熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430~440nm藍(lán)光的照射下,發(fā)出綠色熒光,熒光峰在535nm。維生素B2在pH=6~7的溶
2、液中熒光強(qiáng)度最大,在pH=11的堿性溶液中熒光消失,所以可以用熒光光度法測維生素B2的含量。多維葡萄糖中含有維生素B1、B2、C、D2及葡萄糖,其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光,維生素B1本身無熒光,在堿性溶液中用鐵氰化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光,維生素D2用二氯乙酸處理后才有熒光,他們都不干擾維生素B2的測定。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素,光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多,故測維生素B2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi),且在避光條件下進(jìn)行。試劑與儀器970CRT熒光光度計5ml吸量管1只,2
3、ml吸量管1只,50ml容量瓶6只,100ml容量瓶1只10.0μg/ml維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液,冰乙酸,多維葡萄糖粉試樣.實驗步驟(一)、970CRT熒光光度計基本操作:1.打開氙燈,再打開主機(jī),然后打開計算機(jī)啟動工作站并初始化儀器,預(yù)熱30min2.儀器初始化完畢后,在工作界面上選擇測量項目,設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù):設(shè)置激發(fā)波長為440nm,發(fā)射波長為540nm,靈敏度=2,入射縫寬和出射縫寬均為10nm。3.樣品測定1)、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度的測定:???在6個干凈的50ml容量瓶中,分別吸取0.50、
4、1.00、1.50,2.00,2.50和3.00維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液,各加入2.00ml冰乙酸,稀釋至刻度,搖勻。得到不同濃度的溶液分別是:0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6ug/ml的維生素B2溶液,從稀到濃測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。2)、未知試樣的測定:稱取0.7481g多維葡萄糖粉試樣,用少量水溶解后轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中,加2.00ml冰乙酸,稀釋至刻度,搖勻。用測定標(biāo)準(zhǔn)系列時相同的條件,平行測量其熒光強(qiáng)度3次4、退出主程序,關(guān)閉計算機(jī),先關(guān)主機(jī),最后關(guān)氙燈。數(shù)據(jù)處理1.用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度繪制
5、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。熒光強(qiáng)度(I)濃度(μg/ml)123平均值3.36703.38803.42503.39330.18.45508.49208.48608.47760.213.349013.439013.488013.42530.318.563018.641018.691018.63160.423.440023.438023.485023.45430.528.240028.305028.419028.32130.6?2、未知樣品濃度的測定根據(jù)待測液的熒光強(qiáng)度,從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度,計算出試樣中含量。編號123平均值
6、If25.43025.57725.55125.519C/ug.ml-10.5400.5430.5420.542???維生素B2百分含量=(0.542*50.00)/(0.7481*106)*100%=0.00362%注意事項1.使用970CRT時,要按照儀器使用規(guī)定使用,不可隨意操作2.使用石英比色皿時,要注意勿用手直接觸摸比色皿表面,因握住棱。思考題1.試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因?答:熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比,提高激發(fā)光強(qiáng)度,可成倍提高熒光強(qiáng)度。同時,提高儀器靈敏度,也可提高熒光光度法的靈敏度。而
7、對于吸收光度法,無論是提高激發(fā)光強(qiáng)度提高儀器靈敏度還是提高儀器靈敏度,入射光和出射光同時增大,其靈敏度不變。因此,熒光光度法較吸收光度法靈敏度高2.維生素B2在pH=6~7時熒光最強(qiáng),本實驗為何在酸性溶液中測定?答:因為維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射,會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素,后者的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多。因此,測量時溶液要控制在酸性范圍內(nèi),且必須在避光條件下進(jìn)行。