2.熒光光度法測定維生素B2的含量

《2.熒光光度法測定維生素B2的含量》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、實驗五熒光光度法測定維生素B2的含量一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)熒光分光光度法測定維生素B2的分析原理；2、掌握熒光分光光度計的操作技術(shù)和測定維生素B2的方法。二、實驗原理1.熒光光度法原理（1）常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。在稀溶液中，熒光強度IF與物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系：當(dāng)實驗條件一定時，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系：這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。（2）熒光分析法的特點：a.與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏

2、度。b.選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來鑒定物質(zhì)。c.所需試樣量少、操作方法簡便。（3）熒光光譜激發(fā)光譜：固定測量波長(選最大發(fā)射波長)，化合物發(fā)射的熒光強度與照射光波長的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大。發(fā)射光譜：固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),化合物發(fā)射的熒光強度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。固定發(fā)射光波長進行激發(fā)光波長掃描，找出最大激發(fā)光波長，然后固定激發(fā)光波長進行熒光發(fā)射波長掃描，找出最大熒光發(fā)射波長。激發(fā)光波長和發(fā)射熒光波長的選擇是本實驗的關(guān)鍵。（4）熒光分析儀器常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測器和顯示記錄

3、器五部分構(gòu)成，如下圖所示：I0液槽顯示器單色器檢測器I0IIf光源單色器2.熒光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430～440nm藍光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535nm。維生素B2在pH=6～7的溶液中熒光強度最大，在pH=11的堿性溶液中熒光消失，所以可以用熒光光度法測維生素B2的含量。多維葡萄糖中含有維生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光，維生素B1本身無

4、熒光，在堿性溶液中用鐵氰化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光，維生素D2用二氯乙酸處理后才有熒光，他們都不干擾維生素B2的測定。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強的多，故測維生素B2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進行。三、試劑與儀器儀器：970CRT熒光光度計，5ml吸量管1只，2ml吸量管1只，50ml容量瓶6只,100ml容量瓶1只，試劑：10.0μg/ml（實際濃度請自己記錄）維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰乙酸，試樣若干四、實驗步驟970CRT熒光光度計的基本操作1.先打開氙燈，再打開主機，然后打開計算機電源，熒光光度計工作站自動

5、啟動并初始化儀器，預(yù)熱20—30min2.儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)例如：設(shè)置激發(fā)波長為440nm，發(fā)射波長為330nm，靈敏度＝2，入射縫寬和出射縫寬均為10nm。3.樣品測定(1)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強度的測定：?在6個干凈的50ml容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入2.00ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。得到不同濃度的溶液分別是：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ug/ml的維生素B2溶液，從稀到濃測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強度。(2)未知試樣的測定:準(zhǔn)

6、確稱取一片維生素B2片,用研缽研細(xì)，加少量水溶解后（不得超過定容體積），將其全部轉(zhuǎn)入50ml比色管中，于超聲振蕩器中超聲溶解后，定容。將超聲分解后的樣品試液經(jīng)0.45μm膜過濾后,準(zhǔn)確取濾液適量置于50ml比色管中，加2.00ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標(biāo)準(zhǔn)系列時相同的條件，平行測量其熒光強度3次。（黑體字部分實驗報告中請按自己實際操作撰寫）4.定性實驗：改變狹縫寬度、靈敏度、掃描速度，記錄發(fā)射光譜曲線，進行實驗條件的討論。5.退出主程序，關(guān)閉計算機，先關(guān)主機，最后關(guān)氙燈。?五、實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理1.用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線2．根據(jù)待測液的熒光強度，從標(biāo)準(zhǔn)

7、工作曲線上求得其濃度，計算出試樣中含量。六、思考題1.試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因?2.維生素B2在pH＝6～7時熒光最強，本實驗為何在酸性溶液中測定？3.如何繪制激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜?五．實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理1用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線表一CB2/μg/ml0.1860.3720.5580.7440.9301.116INT45.25588.435132.581178.361215.736269.552圖一2.根據(jù)待測液的熒光強度從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其