熒光光度分析法測(cè)定維生素B2的含量

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1、熒光光度分析法測(cè)定維生素B2的含量引言熒光分光光度法簡(jiǎn)介有些物質(zhì)，當(dāng)用紫外光照射時(shí)，它吸收某種波長(zhǎng)之后還會(huì)發(fā)射出各種顏色和強(qiáng)度不同的光；而當(dāng)紫外光停止照射后，這種光線也隨之消失，這種光線稱為熒光。熒光的波長(zhǎng)比吸收的紫外光波長(zhǎng)要長(zhǎng)。由于物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外光波長(zhǎng)和發(fā)射的熒光波長(zhǎng)也有所不同。利用物質(zhì)的這個(gè)特性，可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。同一種分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，用同一種波長(zhǎng)的紫外光照射，可發(fā)射相同波長(zhǎng)的熒光；若該物質(zhì)的濃度不同，所發(fā)射的熒光強(qiáng)度也不同，利用這個(gè)性質(zhì)可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。這種定量方法稱為熒光分析法，簡(jiǎn)稱熒光法。測(cè)量熒光的儀器有濾光片熒光計(jì)，濾

2、光片—單色器熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)。熒光法的選擇性好，靈敏度比紫外-可見(jiàn)分光光度法高2~3數(shù)量級(jí)，檢出限低，可以達(dá)到10~12g／m1，線性范圍寬。現(xiàn)在主要應(yīng)用的是熒光分光光度計(jì)?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)熒光光度法測(cè)定維生素B2的含量的基本原理和方法。2.熟悉熒光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及使用方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】在經(jīng)過(guò)紫外光或波長(zhǎng)較短的可見(jiàn)光照射后，一些物質(zhì)會(huì)發(fā)射出比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度IF與物質(zhì)的濃度c有以下關(guān)系：當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系：這種以測(cè)量熒光的強(qiáng)度和波長(zhǎng)為基礎(chǔ)的分析方法叫做熒光光度分析法。熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正

3、比，提高激發(fā)光強(qiáng)度，可成倍提高熒光強(qiáng)度。同時(shí)，提高儀器靈敏度，可提高熒光光度法的靈敏度。而吸收光度法，無(wú)論是提高激發(fā)光強(qiáng)度還是提高儀器靈敏度，入射光和出射光同時(shí)增大，其靈敏度不變。因此，熒光光度法比吸收光度法靈敏度高。VB2(即核黃素)在430～440nm藍(lán)光照射下，發(fā)出綠色熒光，其峰值波長(zhǎng)為535nm。VB2的熒光強(qiáng)度在pH6～7時(shí)，在pH=11時(shí)基本消失。維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無(wú)臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：VB2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430～440nm藍(lán)光的照射下，發(fā)

4、出綠色熒光，熒光峰在535nm。維生素B2的熒光強(qiáng)度在pH=6～7時(shí)最強(qiáng)，在pH=11的堿性溶液中熒光消失，所以可以用熒光光度法測(cè)定維生素B2的含量。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強(qiáng)的多，故測(cè)定維生素B2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行?！緝x器與試劑】1.儀器熒光光度計(jì)；容量瓶(50、1000mL)；吸量管(5mL)；棕色試劑瓶；洗瓶2.試劑VB2對(duì)照品；市售VB2片；1％HAc溶液【實(shí)驗(yàn)步驟】1.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制(1)10.0mg／LVB2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取10.0mgVB2，將

5、其溶解于少量的1％HAc溶液中，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用1％HAc溶液稀釋至刻度，搖勻。該溶液應(yīng)裝于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存。(2)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制準(zhǔn)確移取1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL和5.00mL的標(biāo)準(zhǔn)VB2溶液，分別加入5個(gè)干凈的50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。2.待測(cè)樣品液的配制取市售VB2一片，用1％HAc溶液溶解，定容成1000mL，貯存于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存。3.標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定開(kāi)啟儀器，預(yù)熱。用蒸餾水作空白，合上樣品室蓋，接通電源，調(diào)讀數(shù)至“0”。用標(biāo)準(zhǔn)溶液中最濃的溶液，調(diào)節(jié)“滿度”旋鈕使其熒

6、光讀數(shù)為滿刻度，用此作為熒光測(cè)量的基準(zhǔn)；然后，從稀至濃的順序分別測(cè)量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度。4.未知試樣的測(cè)定取待測(cè)樣品液2.50mL置于50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。用與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的條件，測(cè)量待測(cè)樣品液的熒光強(qiáng)度，平行測(cè)量其熒光強(qiáng)度3次?！緮?shù)據(jù)記錄和結(jié)果處理】1.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。管號(hào)VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液（mL）蒸餾水（mL）VB2濃度（mg/mL）I（熒光強(qiáng)度）1050021490.000232.0480.000443.0470.000654.0460.000865.0450.0012.根據(jù)待測(cè)樣品液的熒光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得樣品液的濃度。樣

7、品編號(hào)123平均值I（熒光強(qiáng)度）樣品液的濃度3.計(jì)算藥片中VB2的含量：_____________mg／片。【注意事項(xiàng)】1.在測(cè)量熒光強(qiáng)度時(shí)，最好用同一個(gè)熒光皿，以避免由于熒光皿之間的差異而引起的測(cè)量誤差。2.取熒光皿時(shí)，手指拿住棱角出，切不可碰光面，以免污染熒光皿，影響測(cè)量。【思考題】1.熒光法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性，定量的測(cè)定與紫外分光光度法的異同？2.熒光法測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題?3.試解釋熒光光度法比吸收光度法靈敏度高的原因?