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1、熒光光度分析法測定維生素B2的含量引言熒光分光光度法簡介有些物質(zhì),當(dāng)用紫外光照射時,它吸收某種波長之后還會發(fā)射出各種顏色和強度不同的光;而當(dāng)紫外光停止照射后,這種光線也隨之消失,這種光線稱為熒光。熒光的波長比吸收的紫外光波長要長。由于物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同,所吸收的紫外光波長和發(fā)射的熒光波長也有所不同。利用物質(zhì)的這個特性,可以對物質(zhì)進行定性分析。同一種分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì),用同一種波長的紫外光照射,可發(fā)射相同波長的熒光;若該物質(zhì)的濃度不同,所發(fā)射的熒光強度也不同,利用這個性質(zhì)可以對物質(zhì)進行定量分析。這種定量方法稱為熒光分析法,簡稱熒光法。測量熒光的儀器有濾光片熒光計,濾
2、光片—單色器熒光計和熒光分光光度計。熒光法的選擇性好,靈敏度比紫外-可見分光光度法高2~3數(shù)量級,檢出限低,可以達到10~12g/m1,線性范圍寬。現(xiàn)在主要應(yīng)用的是熒光分光光度計?!緦嶒?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)熒光光度法測定維生素B2的含量的基本原理和方法。2.熟悉熒光光度計的結(jié)構(gòu)及使用方法?!緦嶒炘怼吭诮?jīng)過紫外光或波長較短的可見光照射后,一些物質(zhì)會發(fā)射出比入射光波長更長的熒光。在稀溶液中,熒光強度IF與物質(zhì)的濃度c有以下關(guān)系:當(dāng)實驗條件一定時,熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系:這種以測量熒光的強度和波長為基礎(chǔ)的分析方法叫做熒光光度分析法。熒光強度與激發(fā)光強度成正
3、比,提高激發(fā)光強度,可成倍提高熒光強度。同時,提高儀器靈敏度,可提高熒光光度法的靈敏度。而吸收光度法,無論是提高激發(fā)光強度還是提高儀器靈敏度,入射光和出射光同時增大,其靈敏度不變。因此,熒光光度法比吸收光度法靈敏度高。VB2(即核黃素)在430~440nm藍光照射下,發(fā)出綠色熒光,其峰值波長為535nm。VB2的熒光強度在pH6~7時,在pH=11時基本消失。維生素B2(又叫核黃素,VB2)是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶,其結(jié)構(gòu)式為:VB2易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑,在中性或酸性溶液中穩(wěn)定,光照易分解,對熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430~440nm藍光的照射下,發(fā)
4、出綠色熒光,熒光峰在535nm。維生素B2的熒光強度在pH=6~7時最強,在pH=11的堿性溶液中熒光消失,所以可以用熒光光度法測定維生素B2的含量。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素,光黃素的熒光比核黃素的熒光強的多,故測定維生素B2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi),且在避光條件下進行。【儀器與試劑】1.儀器熒光光度計;容量瓶(50、1000mL);吸量管(5mL);棕色試劑瓶;洗瓶2.試劑VB2對照品;市售VB2片;1%HAc溶液【實驗步驟】1.標準系列溶液的配制(1)10.0mg/LVB2標準溶液的配制準確稱取10.0mgVB2,將
5、其溶解于少量的1%HAc溶液中,轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中,用1%HAc溶液稀釋至刻度,搖勻。該溶液應(yīng)裝于棕色試劑瓶中,置陰涼處保存。(2)標準系列溶液的配制準確移取1.00mL,2.00mL,3.00mL,4.00mL和5.00mL的標準VB2溶液,分別加入5個干凈的50mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。2.待測樣品液的配制取市售VB2一片,用1%HAc溶液溶解,定容成1000mL,貯存于棕色試劑瓶中,置陰涼處保存。3.標準溶液的測定開啟儀器,預(yù)熱。用蒸餾水作空白,合上樣品室蓋,接通電源,調(diào)讀數(shù)至“0”。用標準溶液中最濃的溶液,調(diào)節(jié)“滿度”旋鈕使其熒
6、光讀數(shù)為滿刻度,用此作為熒光測量的基準;然后,從稀至濃的順序分別測量系列標準溶液的熒光強度。4.未知試樣的測定取待測樣品液2.50mL置于50mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。用與測定標準溶液相同的條件,測量待測樣品液的熒光強度,平行測量其熒光強度3次?!緮?shù)據(jù)記錄和結(jié)果處理】1.標準曲線繪制。管號VB2標準溶液(mL)蒸餾水(mL)VB2濃度(mg/mL)I(熒光強度)1050021490.000232.0480.000443.0470.000654.0460.000865.0450.0012.根據(jù)待測樣品液的熒光強度,從標準曲線上求得樣品液的濃度。樣
7、品編號123平均值I(熒光強度)樣品液的濃度3.計算藥片中VB2的含量:_____________mg/片。【注意事項】1.在測量熒光強度時,最好用同一個熒光皿,以避免由于熒光皿之間的差異而引起的測量誤差。2.取熒光皿時,手指拿住棱角出,切不可碰光面,以免污染熒光皿,影響測量?!舅伎碱}】1.熒光法對物質(zhì)進行定性,定量的測定與紫外分光光度法的異同?2.熒光法測定過程中應(yīng)注意哪些問題?3.試解釋熒光光度法比吸收光度法靈敏度高的原因?