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1、熒光光度分析法測定維生素B2一、實驗?zāi)康?．學(xué)習(xí)和掌握熒光光度分析法的基本原理和方法。2．熟悉熒光分光光度計(或熒光光度計)的結(jié)構(gòu)和使用方法。二、實驗原理在紫外光或波長較短的可見光照射后，一些物質(zhì)會發(fā)射出比入射光波長更長的熒光。以測量熒光強度和波長為基礎(chǔ)的分析方法叫做熒光分光光度分析法。對同一物質(zhì)而言，若alc<<0.05，即對很稀的溶液，熒光強度F與該物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系F=2.3φfI0alc式中：φf—熒光過程的量子效率；I0—入射光強度；a—熒光分子的吸收系數(shù)；l—試液的吸收光程。I0和l不變時F=Kc式中K為常
2、數(shù)。因此,在低濃度的情況下，熒光物質(zhì)的熒光強度與濃度呈線性關(guān)系。維生素B2(即核黃素)在430~440nm藍光的照射下，發(fā)出綠色熒光，其峰值波長為535nm。維生素B2的熒光在pH=6~7時最強，在pH=11時消失。圖1VB2的吸收（激發(fā)）光譜及熒光光譜示意圖A—吸收光譜F—熒光光譜熒光分析實驗首先選擇激發(fā)光單色器波長和熒光單色器波長，基本原則是使測量獲得最強熒光，且受背景影響最小。激發(fā)光譜是選擇激發(fā)光單色器波長的依據(jù)，熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜是指在熒光最強的波長處，改變激發(fā)光單色器的波長測量熒光強度，用熒光強度對激發(fā)光波長作圖所
3、得的譜圖。大多數(shù)情況下，熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與其吸收光譜相同。熒光光譜是選擇熒光單色器波長的主要依據(jù)，熒光物質(zhì)的熒光光譜是將激發(fā)光單色器波長固定在最大激發(fā)光波長處，改變熒光單色器波長測量熒光強度，用熒光強度對熒光波長作圖所得的譜圖。3圖1為維生素B2的吸收（激發(fā)）光譜及熒光光譜示意圖。本實驗采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定維生素B2的含量。激發(fā)光單色器波長選440nm。熒光單色器波長選535nm，可將440nm的激發(fā)光及水的拉曼光（360nm）濾除，從而避免了它們的干擾。三、主要儀器與試劑1．儀器日立F-4500型熒光光度計容量瓶（50m
4、L，1L）吸量管（5mL）棕色試劑瓶（500mL）洗瓶（500mL）冰箱2．藥品（1）100.0mg·L－1維生素B2標(biāo)準(zhǔn)貯備液準(zhǔn)確稱取0.1000g維生素B2,將其溶解于少量的1%乙酸中，轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中，用1%乙酸稀釋至刻度，搖勻。（2）5.00mg·L－1維生素B2工作標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確移取5.00mL100.0mg·L－1維生素B2標(biāo)準(zhǔn)貯備液于1L容量瓶中，用1%乙酸稀釋至刻度，搖勻。（3）待測液取市售維生素B2一片，用1%乙酸溶液溶解，在1L容量瓶中定容。以上溶液均應(yīng)裝于棕色試劑瓶中，置于冰箱冷藏保存。四、實驗步驟安全
5、預(yù)防：乙酸具有腐蝕性，避免直接接觸1．標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制在五個干凈的50mL容量瓶中，分別加入1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL和5.00mL5.00mg·L－1維生素B2工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。2．標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測定開啟儀器電源，預(yù)熱約10min。用蒸餾水作空白，從稀到濃測量標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強度。3．未知試樣的測定取2.50mL待測液置于50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。用測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液時相同的條件，測量其熒光強度。（儀器操作方法見熒光光度計或有關(guān)儀器說明書。）五、數(shù)據(jù)處理
6、1．用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。32．根據(jù)待測液的熒光強度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其濃度。3．計算藥片中維生素B2的含量，用mg/片表示。六、思考題1．怎樣選擇激發(fā)光單色器波長和熒光單色器波長？2．熒光光度計中為什么不把激發(fā)光單色器和熒光單色器安排在一條直線上？參考文獻1、郭堯君.熒光實驗技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，1979.11，180~182.2、張俊清.維生素B2片中維生素B2的熒光測定法[J].海南大學(xué)學(xué)報，1997，15(4)：324~3263
