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1、甜瓜同源基因的克隆及表達特性分析摘要：干旱、寒冷、鹽堿等非生物逆境是制約著植物生長的主要因素，在目前生態(tài)環(huán)境日益惡化的狀況下，提高植物的抗逆性有關(guān)研究無疑具有重大意義Uj。運用基因工程手段來提高植物的抗逆性則比傳統(tǒng)育種方式更有優(yōu)勢［2］。目前研究表明，SKIP基因作為一種植物抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在逆境脅迫中呈現(xiàn)表達量的明顯增加。本實驗應(yīng)用RT-PCR技術(shù)克隆得到甜瓜S/C/P同源基因。利用Real-timePCR技術(shù)檢測基因?qū)μ鸸细?、莖、葉不同組織屮的表達情況進行初步鑒定。關(guān)鍵詞：甜瓜SKIP同源基因克隆Real-TimePCR1緒論1.1SKIP基因及其蛋白功能
2、1.1.1SKIP蛋白的結(jié)構(gòu)特點幾乎在所有的真核生物基因組中都存在編碼SA7P(Ski-interactingprotein)的基因，從低等真核生物到高等的動、植物中都有拷貝。SKIP蛋白大小約60-80KDa,一般情況下定位于細胞核中從氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)比較可以發(fā)現(xiàn)，SKIP蛋白的基本結(jié)構(gòu)中含有多個其它蛋白所不具有的高度保守的結(jié)構(gòu)。并且這些保守的區(qū)域幾乎都是SKIP所特有的，即在其它的蛋白質(zhì)屮沒有發(fā)現(xiàn)它們的同源序列,其中SNWKN是最典型的高度保守的基序。某些物種的SKIP蛋白還奮一些顯著的磷酸化位點。預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)顯示，在第299位氨基酸到第360位氨基酸
3、之間存在一個a螺旋，其等電點很高，是很多互作蛋白結(jié)合的部位［41。而且它的其他部分也可以和不同蛋白質(zhì)相結(jié)合，因此SKIP能夠與多種類型的蛋白質(zhì)發(fā)生互作［3］。此外，SKIP蛋白的有些部分還存在一種部分折疊的狀態(tài)，以便于它在和不同蛋白互作后發(fā)生可以完成再次折疊W，這樣的結(jié)構(gòu)特點使它具有超強的與蛋白發(fā)生互作的能力(Alonsoetal.,2002)oSKIP家族進化樹比較中，除酵母中的PRp45外大多數(shù)蛋白都具有相同的序列特征。這個蛋白不僅缺失N端部分，余下的區(qū)域特征與其它蛋白的相似性也較低。1.1.2SKIP的功能及研究現(xiàn)狀SKIP蛋白的功能可以概括為兩大類，一個
4、是作為RNA剪切復(fù)合體的組成部分參與前體mRNA的剪切、轉(zhuǎn)錄延伸及成熟mRNA的運輸［3］;另一個則是根據(jù)其結(jié)合的蛋白的不同，在與其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體的表達屮，進行共調(diào)節(jié)與共抑制的轉(zhuǎn)換角色W。自20世紀80年代，SKIP同源蛋白在果蠅中被首次鑒定并命名為Bx42以來,在其他物種中的研宄隨即展開1998年，人類的SKIP被證明參與了剪接復(fù)合體，隨后釀酒酵母的PRP45也被認為是完成mRNA的剪接過程中不可或缺的輔助因子［8］。并且，釀酒酵母PRP45蛋白也被報道含有SNW/SKIP結(jié)構(gòu)域，并在保持細胞活性中發(fā)揮重要功能。雖然SKIP蛋白家族成員本身具
5、奮極蘇保守的結(jié)構(gòu)和序列，但不同種類生物中的SKIP蛋白具有其完全不同的結(jié)合蛋白，這也表明該蛋白在基本功能上進化和衍生出來的新功能在不同物種中都各不相同f91。根據(jù)對水稻、擬南芥等模式植物的研允過程顯示，植物除了通過表達特定基因提高植物耐受性以外，RNA剪接的調(diào)控也是一種植物抵抗外界非生物逆境脅迫的方式L1Qj。對擬南芥SKIP同源基因AtSKIP基因研究表明，SKIP是mRNA剪接的轉(zhuǎn)錄因子，在前體mRNA剪接作用中通過直接與前體mRNA結(jié)合發(fā)揮左右，而且AtSKIP蛋白既是一個積極的調(diào)節(jié)因子也是潸在的轉(zhuǎn)錄因子，在非生物逆境脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中也起到一定的作用。
6、在對于水稻抗逆基因OsSKIPa研宂中發(fā)現(xiàn)，OsSKIPa能夠調(diào)整細胞活力及抗逆性。轉(zhuǎn)基因水稻屮OsSKIPa的表達極人地提高了植株在逆境中的生長階段的抗旱能力，增加清除活性氧的能力和提高干旱脅迫下于逆境相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平［3］。2012年張彥威從大豆中克隆得到一個編碼SKIP的基因，命名為GmGBPl，在PEG6000干旱脅迫處理大豆葉片中發(fā)現(xiàn)，葉片中GmGBP/基因呈正調(diào)控應(yīng)答，且在4h時達到高峰［11］。王小敏等人通過對玉米SKIP同源基因克隆得到ZmSKIP基因，并對玉米屮ZmSKIP氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，ZmSKIP也具奮一個特定核定位信號肽，這與已
7、報道的SKIP蛋白都是核定位蛋白相一致［12］。轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要通過與目的基因啟動子中特定元件的結(jié)合來調(diào)控下游基因的表達，發(fā)揮其生物功能，而SKIP是真核生物中的轉(zhuǎn)錄共激活子，在轉(zhuǎn)錄和剪接屮發(fā)揮保守的共激活的作用。并且SKIP通過與不同蛋白互作，更突顯其在mRNA生成的不同階段的多個環(huán)節(jié)中的功能。冋吋，S/C/P還作為重要的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)植物抵抗逆境脅迫的能力。1.2研究的意義及技術(shù)路線1.2.1研究的意義鹽堿、寒冷和干旱等逆境環(huán)境對植物生長發(fā)育的影響具有重耍影響，并且間接關(guān)系到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的質(zhì)量和產(chǎn)量問題。改善作物的抗旱、耐鹽性已經(jīng)成為當今植物研究屮需解決的重要問題
8、。水資源的缺乏已成為威脅
