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1、南京林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文柳樹AP3同源基因的克隆與表達(dá)分析姓名：關(guān)亞麗申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：林木遺傳育種指導(dǎo)教師：王明庥;黃敏仁20060601摘要dP3基因在植物的花發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，作為“ABC”模型的B類基因，AP3或丹與AG的作用決定雄蕊的特征。根據(jù)已知的楊樹AP3同源基因PTD的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，以垂柳、黃花柳、黃枝白柳、杞柳、綿毛柳及簸箕柳總DNA為模板，均擴(kuò)增出了大小約2．1K左右的片段。根據(jù)簸箕柳DNA測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，利用RT—PCR技術(shù)及5’RACE、3’PACE技術(shù)，獲得了簸箕柳中AP3同源基因的全長(zhǎng)cDNA序列。該基因cDNA
2、全長(zhǎng)為826bp，編碼241個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大小為28kDa。根據(jù)基因組擴(kuò)增片斷測(cè)序結(jié)果以及簸箕柳SSMADS基因全長(zhǎng)cDNA序列，預(yù)測(cè)出垂柳、黃花柳、黃枝白柳、杞柳、綿毛柳中／503同源基因的全長(zhǎng)eDNA。分析表明，本實(shí)驗(yàn)所克隆的柳屬植物AP3同源基因，在核苷酸水平和氨基酸水平均有很高的相似性，分別為95％-98．7％和95．2％一99．6％，雖然它們?cè)谛蛄猩细饔胁町悾烤哂蠥P3基因所特有的保守區(qū)域，說(shuō)明該基因在柳屬植物中具有較好的保守性。通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT—PCR分析，發(fā)現(xiàn)SSg：II)S基因主要在簸箕柳花器官中表達(dá)，在根、莖、葉中雖然有少量表達(dá)，
3、但表達(dá)量很低。在花器官發(fā)育的不同階段，SSMADS基因表達(dá)量也不同，在花發(fā)育的早期階段，其表達(dá)量較低，隨著花器官的發(fā)育，其表達(dá)量有所增加，然后隨著花器官的成熟表達(dá)量又降低。將水稻AP3同源基因OsMADSl6的RNAi植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，得到95株潮霉素抗性芽。當(dāng)芽長(zhǎng)到1．5cmc以上時(shí)，移入附加有hygromycin50mg／L的MS培養(yǎng)基上，大部分植株在20天左右都能正常生根。對(duì)22株轉(zhuǎn)基因抗性植株進(jìn)行檢測(cè)，18株為PCR陽(yáng)性。轉(zhuǎn)基因煙草在轉(zhuǎn)化前后花器官的表型變化尚在觀察之中。煙草轉(zhuǎn)化的成功為進(jìn)行簸箕柳的轉(zhuǎn)化奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。以簸
4、箕柳當(dāng)年春季萌生的新枝條為外植體，建立了其植株再生體系。探討了基本培養(yǎng)基和不同組合的激素對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明不同基本培養(yǎng)基對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)無(wú)太大影響，而BA為1．0mg／L、NAA為0．01mg／L時(shí)，叢生芽誘導(dǎo)率達(dá)到了最大，為100％；平均誘導(dǎo)芽數(shù)為3個(gè)／株；芽的生長(zhǎng)狀況也較好。當(dāng)叢生芽長(zhǎng)到3cm左右時(shí)，切下，在不加激素的White或B5兩種基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)其生根，生根率可達(dá)90％以上。簸箕柳組培再生體系的建立為進(jìn)一步用轉(zhuǎn)基因方法驗(yàn)證簸箕柳AP3同源基因的功能提供了技術(shù)平臺(tái)。關(guān)鍵詞：簸箕柳；AP3同源基因；克??；表達(dá)分析；煙草轉(zhuǎn)化AbstractAP3p
5、laysimportantrolesinfloraldevelopment．AsaBclassgeneof“ABC”model，AP3orP／andAGcontrolthedevelopmentofstalnentogether．ApairofprimersweredesignedaccordingtOpublishedPopulustrichocarpagene(PTD)，andan2．1Kfragmentwasamplified(PCR)byusingthegenomicDNAofSalix．Babylonica，Salix,caprea，Salix．a(chǎn)l
6、baf,Salix．integra,Salix．eriocladaandSal及．suchowensisrespectively．Byusing5’RACEand3’RACEtechnique．thehomologueAP3genewasobtainedintheS．suchowensis．ThecompletedcDNAsequenceWas826bpandencodedforapolypeptideof241aminoacids，28KDmolecularweight．AccordingtOthefoil—lengtheDNAofS．suchowensis
7、andthegenomicDNAsequences，thefull—lengthcDNAsequencesofhomologueAP3inS．babylonica，S．caprea,S．a(chǎn)lbafS．integraandS．eriocladawerepredicted．TheresultindicatedthatthehomologueAP3genesofSalixwerehJIghconservative．with95％-98．7％identityofnucleotidesand95．2％一99．6％ofproteins．Todeterminetheexpr
8、essionpattemofSSMAD
