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《當(dāng)歸注射液對免疫誘導(dǎo)再障小鼠骨髓微環(huán)境及il 》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、當(dāng)歸注射液對免疫誘導(dǎo)再障小鼠骨髓微環(huán)境及IL【關(guān)鍵詞】再生障礙性貧血 再生障礙性貧血(aplasticanemia,AA)是血液系統(tǒng)常見疾病，傳統(tǒng)的治療方法效果欠佳，臨床死亡率高。因此，對AA發(fā)病機(jī)制的研究以及尋找有效的治療藥物具有重要的理論和實踐意義。目前對于AA，國內(nèi)多采用中西醫(yī)結(jié)合治療。當(dāng)歸是著名常用中藥，具有養(yǎng)血活血作用〔1〕，過去多用于治療腰腿痛和婦科疾病，隨著臨床研究的進(jìn)展，其應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大。作為補血中藥，其在血液系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用及研究也日漸增多。至目前為止，有關(guān)當(dāng)歸在血液系統(tǒng)的藥理作用基本歸納為：①抑制血小板聚集及抗血
2、栓形成；②刺激骨髓造血；③促進(jìn)免疫功能恢復(fù)；④抗輻射損傷等。武漢大學(xué)人民醫(yī)院兒科從1991年起將當(dāng)歸注射液用于臨床治療AA，取得較好的療效〔2〕。但該藥治療AA的實驗研究卻少有報道。本實驗用當(dāng)歸注射液對免疫誘導(dǎo)AA小鼠進(jìn)行干預(yù)治療，觀察其對AA小鼠體重、外周血白細(xì)胞計數(shù)、骨髓單個核細(xì)胞計數(shù)、骨髓微環(huán)境等的影響，并從分子水平研究其作用機(jī)制，進(jìn)一步為臨床應(yīng)用該藥治療AA提供實驗依據(jù)。1材料與方法11材料111動物雌性Balb/c小鼠(H2a、MLSb)8~12周齡，17~20g，由武漢生物制品研究所提供。DBA/2小鼠(H2a、MLSa)8
3、~10周齡，雌雄不拘，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。112藥品、試劑及來源25%當(dāng)歸注射液由武漢大學(xué)中南醫(yī)院藥劑科提供，批號：0303131，每毫升含當(dāng)歸生藥0.25g。大鼠抗小鼠CD49dRPE單克隆抗體、CD49eFITC單克隆抗體、羊抗大鼠IgGFITC熒光抗體、大鼠抗小鼠細(xì)胞周期蛋白D2單克隆抗體、溴化丙啶(PI)、RnaseA、Triton100均購自深圳晶美公司。Ficoll干粉、人淋巴細(xì)胞分離液購自美國Sigma公司。113試劑配制(1)0.01mol/L磷酸生理鹽水(phosphatebuffersaline,PBS
4、)的配制：磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：3.48g；氯化鉀(KCl)：0.2g；磷酸二氫鉀(KH2PO4)：0.2g；氯化鈉(NaCl)：8.0g。加入1L雙蒸水稀釋后濾紙過濾，消毒，4℃冰箱保存待用。(2)小鼠淋巴細(xì)胞分離液的配制：Ficoll干粉2.1g加入20ml雙蒸水，配成10.5%溶液，過濾待用，用人淋巴細(xì)胞分離液100ml加入配制好的10.5%Ficoll溶液7ml，配成小鼠淋巴細(xì)胞分離液。過濾消毒，4℃冰箱避光保存待用。(3)臺盼藍(lán)的配制：4%臺盼藍(lán)母液：取4g臺盼藍(lán)溶入100mlPBS中，過濾消毒，4℃冰箱保存待用。工作
5、濃度為0.4%。114主要儀器(1)AIRTECH超凈工作臺：江蘇安泰空氣凈化技術(shù)公司生產(chǎn)；(2)網(wǎng)格測微器：購自上海森雄公司；(3)博賽酶標(biāo)儀。12動物模型的制備與分組121免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠模型的建立參照姚軍等〔3〕方法，取DBA/2小鼠，斷頸處死，常規(guī)75%酒精消毒，無菌取出胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝、腸系膜等處淋巴結(jié)，加少量生理鹽水，輕輕磨碎，過濾后用1ml注射器抽取，并將此液沿管壁緩慢加入裝有配制好的小鼠淋巴細(xì)胞分離液的試管中，置水平離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速2000轉(zhuǎn)/分，20分鐘后取出，可見淋巴細(xì)胞懸液在中間層，用無菌吸
6、管將淋巴細(xì)胞懸液吸出后，用PBS沖洗二遍，離心機(jī)離心，1500轉(zhuǎn)/分，5分鐘，棄上清，配成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活性，活性細(xì)胞達(dá)98%。計數(shù)后配成所需濃度備用。雌性Balb/c小鼠，經(jīng)60Co6Gyγ-射線亞致死量全身照射(空氣量7.39Gy，距離80cm，時間6.87min)。4小時內(nèi)由尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴結(jié)混合細(xì)胞，細(xì)胞量為每只1×106/0.2ml。122分組與處理制模后小鼠分為4組，分別為模型對照組、當(dāng)歸注射液小劑量組、當(dāng)歸注射液大劑量組、丙酸睪丸酮組，每組8只，另設(shè)8只同批正常未經(jīng)任何處理Balb/c小鼠
7、為正常對照組。①正常對照組：予無菌生理鹽水10ml/kg.d腹腔注射，連續(xù)12天。②模型對照組：于制模當(dāng)天腹腔注射無菌生理鹽水10ml/kg.d，連續(xù)12天。③、④當(dāng)歸注射液小劑量組、當(dāng)歸注射液大劑量組：分別于制模當(dāng)天給予當(dāng)歸注射液注射液2ml/kg.d及10ml/kg.d腹腔注射。⑤丙酸睪丸酮組：于制模當(dāng)天腹腔注射丙酸睪丸酮10mg/kg.d。所有小鼠均給予每升含紅霉素250mg及慶大霉素320萬U的無菌水喂養(yǎng)。13檢測的指標(biāo)及方法131體重變化、外周血白細(xì)胞和骨髓單個核細(xì)胞計數(shù)于制模第12天小鼠稱重后，經(jīng)尾靜脈采血，按常規(guī)方法行外周
8、血白細(xì)胞計數(shù)后，斷頸處死，取右側(cè)股骨，用PBS沖出骨髓細(xì)胞，計數(shù)，即為1根股骨中的骨髓單個核細(xì)胞(mononucleatecells,MNC)。132尺骨骨髓切片組織學(xué)觀察取尺骨固定，塑料包埋切片，HGE染
