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1、當(dāng)歸注射液對免疫誘導(dǎo)再障小鼠骨髓微環(huán)境及IL論文【關(guān)鍵詞】再生障礙性貧血再生障礙性貧血(aplasticanemia,AA)是血液系統(tǒng)常見疾病，傳統(tǒng)的治療方法效果欠佳，臨床死亡率高。因此，對AA發(fā)病機(jī)制的研究以及尋找有效的治療藥物具有重要的理論和實(shí)踐意義。目前對于AA，國內(nèi)多采用中西醫(yī)結(jié)合治療。當(dāng)歸是著名常用中藥，具有養(yǎng)血活血作用［1］，過去多用于治療腰腿痛和婦科疾病，隨著臨床研究的進(jìn)展.freela公司。113試劑配制(1)0.01mol/L磷酸生理鹽水(phosphatebuffersaline,PBS)的配制：磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：3.48g；氯化鉀(K
2、Cl)：0.2g；磷酸二氫鉀(KH2PO4)：0.2g；氯化鈉(NaCl)：8.0g。加入1L雙蒸水稀釋后濾紙過濾，消毒，4℃冰箱保存待用。(2)小鼠淋巴細(xì)胞分離液的配制：Ficoll干粉2.1g加入20ml雙蒸水，配成10.5%溶液，過濾待用，用人淋巴細(xì)胞分離液100ml加入配制好的10.5%Ficoll溶液7ml，配成小鼠淋巴細(xì)胞分離液。過濾消毒，4℃冰箱避光保存待用。(3)臺盼藍(lán)的配制：4%臺盼藍(lán)母液：取4g臺盼藍(lán)溶入100mlPBS中，過濾消毒，4℃冰箱保存待用。工作濃度為0.4%。114主要儀器(1)AIRTECH超凈工作臺：江蘇安泰空氣凈化技術(shù)公司生產(chǎn)；(
3、2)網(wǎng)格測微器：購自上海森雄公司；(3)博賽酶標(biāo)儀。12動(dòng)物模型的制備與分組121免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠模型的建立參照姚軍等［3］方法，取DBA/2小鼠，斷頸處死，常規(guī)75%酒精消毒，無菌取出胸腺及頸部、頜下、腋窩、腹股溝、腸系膜等處淋巴結(jié)，加少量生理鹽水，輕輕磨碎，過濾后用1ml注射器抽取，并將此液沿管壁緩慢加入裝有配制好的小鼠淋巴細(xì)胞分離液的試管中，置水平離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速2000轉(zhuǎn)/分，20分鐘后取出，可見淋巴細(xì)胞懸液在中間層，用無菌吸管將淋巴細(xì)胞懸液吸出后，用PBS沖洗二遍，離心機(jī)離心，1500轉(zhuǎn)/分，5分鐘，棄上清，配成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活性，活性
4、細(xì)胞達(dá)98%。計(jì)數(shù)后配成所需濃度備用。雌性Balb/c小鼠，經(jīng)60Co6Gyγ-射線亞致死量全身照射(空氣量7.39Gy，距離80cm，時(shí)間6.87min)。4小時(shí)內(nèi)由尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴結(jié)混合細(xì)胞，細(xì)胞量為每只1×106/0.2ml。122分組與處理制模后小鼠分為4組，分別為模型對照組、當(dāng)歸注射液小劑量組、當(dāng)歸注射液大劑量組、丙酸睪丸酮組，每組8只，另設(shè)8只同批正常未經(jīng)任何處理Balb/c小鼠為正常對照組。①正常對照組：予無菌生理鹽水10ml/kg.d腹腔注射，連續(xù)12天。②模型對照組：于制模當(dāng)天腹腔注射無菌生理鹽水10ml/kg.d，連續(xù)12天。
5、③、④當(dāng)歸注射液小劑量組、當(dāng)歸注射液大劑量組：分別于制模當(dāng)天給予當(dāng)歸注射液注射液2ml/kg.d及10ml/kg.d腹腔注射。⑤丙酸睪丸酮組：于制模當(dāng)天腹腔注射丙酸睪丸酮10mg/kg.d。所有小鼠均給予每升含紅霉素250mg及慶大霉素320萬U的無菌水喂養(yǎng)。13檢測的指標(biāo)及方法131體重變化、外周血白細(xì)胞和骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)于制模第12天小鼠稱重后，經(jīng)尾靜脈采血，按常規(guī)方法行外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)后，斷頸處死，取右側(cè)股骨，用PBS沖出骨髓細(xì)胞，計(jì)數(shù)，即為1根股骨中的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononucleatecells,MNC)。132尺骨骨髓切片組織學(xué)觀察取尺骨固定，塑料包
6、埋切片，HGE染色，采用浦權(quán)等［4］的方法，于高倍鏡下用網(wǎng)格測微器進(jìn)行骨髓造血組織容量百分率的測定，測其全片骨髓造血組織所占面積(不含骨小梁)的百分比，并觀察微血管和脂肪細(xì)胞。造血組織面積(%)=各網(wǎng)格造血組織面積(%)之總和/測計(jì)全片骨髓的網(wǎng)格總數(shù)133骨髓超微結(jié)構(gòu)樣本制備取尺骨中段，固定于4%戊二醛溶液中，經(jīng)磷酸緩沖液充分沖洗后再固定于1%四氧化鋨中，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片，硝酸鈷和醋酸鈉雙重染色，置于透射電鏡下觀察骨髓造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞變化。134骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液IL3的檢測制模后第12天斷頸處死小鼠，制備MNC懸液，調(diào)濃度為1×107/m
7、l，培養(yǎng)72小時(shí)后收集上清液，采用雙抗體夾心ABCELISA法測IL3量。14統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以±s表示，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P0.05表示差別有顯著性。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果21小鼠體重、外周血白細(xì)胞及骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)改變實(shí)驗(yàn)各組小鼠體重、外周血白細(xì)胞及骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯低于正常對照組(P0.01)，但當(dāng)歸注射液大劑量組及丙酸睪丸酮組較模型對照組明顯增加(P0.01)，且當(dāng)歸注射液大劑量組與丙酸睪丸酮組比較無顯著差異，而當(dāng)歸注射液小劑量組與模型對照組比較無顯著差異。見表1。表1當(dāng)歸注射液對免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠體重、外周血白細(xì)胞及骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)的影
