多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌β

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　　多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌β　?。坳P(guān)鍵詞］多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌;β內(nèi)酰胺酶;基因型　　StudyontheGenotypeofβlactmasesinMultiresistantAciobacterBaumanniiStrain　　Abstract：ObjectiveToinvestigatethedistributionongenotypeofβLactmasesinmultiresistantaciobacterbaumanniistrainisolatedfromourhospital.MethodsThreedimemensionalextracttestsedtodetectthestrainsofESBLsproducingandAmpCproducingandMBLproducingin15MultiresistantAciobacterbaumannii.ThegenotypeofβLactmasesethods.Results2strainsESBLsproducingand9strainsAmpCproducing,3strainsESBLsproducingplusAmpCproducingand3strainsMBLproducingpCproducinghavebeendetectedbythreedimemensionalextracttests.All15strainshaveblaTEMgeneand2strainshaveblaPERgene,14strainshaveAmpCgeneandhaven'tMBLproducinggenebyPCRmethods.ConclusionThemostmultiresistantaciobacterbaumanniihaveblaTEMandAmpCgene,a littlestrainshaveESBLsofPERtypeandnoMBLofIMPtype.　　Keyannii;βLactmases;Genotype　　鮑曼不動(dòng)桿菌是院內(nèi)感染的重要病原體之一，近年來(lái)，許多醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌的分離率在逐年上升，僅次于假單胞菌和大腸埃希菌。同時(shí)，多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌。在其復(fù)雜耐藥機(jī)制中，產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是其主要耐藥機(jī)制［1］。鮑曼不動(dòng)桿菌不僅有產(chǎn)廣譜β內(nèi)酰胺酶，而且近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶、AmpC酶和碳青霉烯酶的鮑曼不動(dòng)桿菌［2］，給臨床治療帶來(lái)很大困難。為了解我院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制，我們對(duì)本院分離的15株多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行了β內(nèi)酰胺酶基因型研究?！　?材料與方法　　1.1菌株15株只對(duì)亞胺培南敏感的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌來(lái)自我院2004年7月至2005年1月臨床分離的標(biāo)本，其中痰液12份（ICU6份，呼吸科4份、腦外科2份）、創(chuàng)面3份（均為骨科）。均經(jīng)Vitek-32型全自動(dòng)微生物鑒定儀（法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品）的VitekGNI鑒定卡統(tǒng)一進(jìn)行鑒定?！　?.2標(biāo)準(zhǔn)菌株 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌ATCC700603、高產(chǎn)AmpC酶陰溝腸桿菌029M標(biāo)準(zhǔn)株由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院惠贈(zèng)；大腸埃希菌ATCC25922由本實(shí)驗(yàn)室保存。　　1.3耐藥性被研究的15株鮑曼不動(dòng)桿菌除了2株耐受亞胺培南，其他13株對(duì)亞胺培南全部敏感；對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦有1株敏感，14株中介；有1株對(duì)氧氟沙星和環(huán)丙沙星敏感；對(duì)氧哌嗪青霉素/他唑巴坦、頭孢吡肟、阿米卡星、頭孢他啶中介各1株；對(duì)其他抗生素均耐受。　　1.4主要試劑克拉維酸（CLA）為南京本原制藥廠贈(zèng)送，氯唑西林（CLO）為上海四藥股份有限公司產(chǎn)品，MH瓊脂為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品，胰蛋白大豆肉湯為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。　　1.5主要儀器設(shè)備微生物鑒定儀為法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek-32型全自動(dòng)微生物鑒定儀；冰箱為日本三洋MDF-382型超低溫冰箱；離心機(jī)為德國(guó)Hettich公司產(chǎn)品MIKRO22R型低溫超速離心機(jī)；PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)PERKINELMER公司9600型基因擴(kuò)增儀。　　1.6酶提取物制備將分離鑒定的細(xì)菌挑取數(shù)個(gè)菌落接種到30ml胰蛋白胨大豆肉湯中，35℃恒溫振蕩培育10h~14h，4℃4000r/min離心30min棄上清液，收集沉淀物加0.1mol/LPBS（pH7.0）400μl，旋渦混勻后于-80℃反復(fù)凍融6次，每次各1h，然后4℃13000r/min離心15min，吸取上清液，經(jīng)過(guò)MH瓊脂平板35℃培養(yǎng)過(guò)夜，無(wú)菌生長(zhǎng)方為合格酶提取物，-80℃ 保存?zhèn)溆??！　?.7三維試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)AmpC酶菌株參照Coudron［3］報(bào)告的酶提取物三維試驗(yàn)作部分改進(jìn)。將0.5麥?zhǔn)蠁挝淮竽c埃希菌ATCC25922菌液均勻涂布在MH瓊脂平皿上，平皿中心貼上30μgFOX紙片，在距FOX紙片邊緣5mm處放射性打出2道長(zhǎng)約10mm~15mm對(duì)稱狹縫，分別加入酶提取物40μl和酶提取物40μl+2mmol/LCLO4μl（避免加入液體溢出狹縫），35℃過(guò)夜培養(yǎng)。結(jié)果判定：若在加入酶提取物的狹縫與抑菌圈交界處出現(xiàn)擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)，而在加入酶提取物+CLO混合液的狹縫（CLO抑制AmpC酶）與抑菌圈交接處未出現(xiàn)擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)，為三維試驗(yàn)高產(chǎn)AmpC酶試驗(yàn)陽(yáng)性；若兩道狹縫與抑菌圈交接處均未出現(xiàn)擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)，為高產(chǎn)AmpC酶陰性。陰溝腸桿菌029M為高產(chǎn)AmpC酶的陽(yáng)性對(duì)照，肺炎克雷伯菌ATCC700603為陰性對(duì)照?！　?.8三維試驗(yàn)檢測(cè)ESBLs和同時(shí)產(chǎn)AmpC酶菌株參照吳偉元等［4］報(bào)道的方法作部分改進(jìn)。對(duì)高產(chǎn)AmpC酶菌株的酶提取物進(jìn)行頭孢曲松（CRO）三維試驗(yàn)，操作方法同上，用CRO紙片代替FOX紙片，并放射性打出4道狹縫，分別加入酶提取物40μl、酶提取物40μl+2mmol/LCLO4μl、酶提取物40μl+2mmol/LCLA4μl、酶提取物40μl+4mmol/LCLO2μl+4mmol/L CLA（克拉維酸）2μl。　　結(jié)果判定：若在加入酶提取物、酶提取物+CLO和酶提取物+CLA道狹縫與抑菌圈交接處均出現(xiàn)擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)，而加入酶提取物+CLO+CLA狹縫與抑菌圈交接處未出現(xiàn)擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)，說(shuō)明該菌同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和ESBLs；若在加酶提取物和酶提取物+CLA的狹縫與抑菌圈交接處出現(xiàn)擴(kuò)大長(zhǎng)菌區(qū)，而另2道狹縫與抑菌圈交接處均未出現(xiàn)擴(kuò)大長(zhǎng)菌區(qū)，說(shuō)明該菌只產(chǎn)AmpC酶，不產(chǎn)ESBLs；若在加酶提取物和酶提取物+CLO的狹縫與抑菌圈交接處出現(xiàn)擴(kuò)大長(zhǎng)菌區(qū)，而另2道狹縫與抑菌圈交接處均未出現(xiàn)擴(kuò)大長(zhǎng)菌區(qū)，說(shuō)明該菌只產(chǎn)ESBLs，不產(chǎn)AmpC酶；若4道狹縫與抑菌圈交接處均出現(xiàn)擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)，說(shuō)明酶提取物中含有ESBLs、AmpC酶以外的耐酶抑制劑β內(nèi)酰胺酶或金屬酶，另進(jìn)行金屬酶檢測(cè)。以大腸埃希菌ATCC25922作陰性質(zhì)控菌株，以肺炎克雷伯菌ATCC700603為ESBLs陽(yáng)性對(duì)照，陰溝腸桿菌029M為高產(chǎn)AmpC酶的陽(yáng)性對(duì)照。　　1.9產(chǎn)MBL菌株的檢測(cè)所有對(duì)亞胺培南耐藥菌株和耐酶抑制劑β內(nèi)酰胺酶菌株均進(jìn)行金屬酶（MBL）檢測(cè)。按照文獻(xiàn)［5］等報(bào)道的協(xié)同法檢測(cè)金屬酶。將0.5麥?zhǔn)蠁挝淮郎y(cè)菌液均勻涂布在MH瓊脂平皿上，稍干后在平皿中心貼上含有EDTA（1mg/片）紙片，在其10mm~15mm的周圍分別貼上亞胺培南（30μg）和頭孢他啶(30μ g)紙片，35℃過(guò)夜培養(yǎng)觀察結(jié)果。若EDTA與其中一種交界處有明顯的抑菌圈擴(kuò)大現(xiàn)象表示待測(cè)菌產(chǎn)金屬碳青霉烯酶?！　?.10β內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)根據(jù)EMBL公布的基因，采用Primer軟件設(shè)計(jì)β內(nèi)酰胺酶基因TEM、SHV、PER1、VEB、AmpC、IMP1、VIM2型引物（見(jiàn)表1）?！　∫锞缮虾Ｉ昴懿┎噬锕竞铣?；質(zhì)粒提取試劑、細(xì)菌基因提取試劑、PCR試劑盒為上海申能博彩生物公司產(chǎn)品。　　PCR產(chǎn)物在含0.5μg/mlEB的1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外光線下觀察結(jié)果,在凝膠成像系統(tǒng)上成像。　　2結(jié)果　　2.1三維試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果單純產(chǎn)ESBLs的有3株，單純產(chǎn)AmpC酶的有10株，同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的有3株。3株菌檢測(cè)EDTA與IPM有協(xié)同作用，為MBL陽(yáng)性?！　?.2β內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)被檢測(cè)的15株鮑曼不動(dòng)桿菌均攜帶blaTEM基因，但均不含有SHV型基因；2株三維試驗(yàn)ESBLs陽(yáng)性的菌株含有blaPER1基因,未檢測(cè)到VEB型產(chǎn)ESBLs基因，三株同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的菌株未檢測(cè)到超廣譜酶基因；在14株鮑曼不動(dòng)桿菌中檢出有AmpC基因，AmpC基因陰性株為1例ESBLs陽(yáng)性株，但另一ESBLs陽(yáng)性而AmpC酶陰性株的AmpC基因檢測(cè)為陽(yáng)性。15株被測(cè)菌均未檢出blaIMP1和blaVIM2金屬酶基因。見(jiàn)表2。 　　表1用于檢測(cè)耐藥基因的引物（略）　　表2三維試驗(yàn)PCR方法檢測(cè)15株鮑曼不動(dòng)桿菌ESBLs、AmpC、MBL結(jié)果（略）　　產(chǎn)ESBLsblaPER1基因首先在法國(guó)發(fā)現(xiàn)于銅綠假單胞菌，后來(lái)在土耳其相繼發(fā)現(xiàn)blaPER1基因編碼產(chǎn)ESBLs的鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌［7］。據(jù)調(diào)查有46%的鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶該基因而且是不同的生物型。后來(lái)在韓國(guó)的不同醫(yī)院也發(fā)現(xiàn)PER1型產(chǎn)ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在于ICU病房，其主要表現(xiàn)為對(duì)三、四代頭孢類全部耐藥，而且對(duì)氨基甙類、喹諾酮類也表現(xiàn)出明顯的耐藥性。目前在其他國(guó)家尚未報(bào)道。從本研究得出：從我院多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌中，發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)ESBLsblaPER1型基因,這是首次在我國(guó)發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌帶有該基因（我們將做后繼測(cè)序等鑒定工作）。說(shuō)明blaPER1型產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶鮑曼不動(dòng)桿菌在我國(guó)已經(jīng)存在，雖然數(shù)量不多，但具有一定的流行病學(xué)價(jià)值，對(duì)認(rèn)識(shí)多重耐藥菌的產(chǎn)生有重要意義。該基因是突變而來(lái)，還是從其他細(xì)菌中轉(zhuǎn)導(dǎo)而來(lái)，有待研究?！　‰m然產(chǎn)VEB型ESBLs鮑曼不動(dòng)桿菌在歐洲已有發(fā)現(xiàn)，但我院并未發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)ESBLs基因型的鮑曼不動(dòng)桿菌。有3株菌從三維試驗(yàn)中檢測(cè)有ESBLs，而基因檢測(cè)為陰性，很可能是高產(chǎn)AmpC酶干擾所致。 　　在歐洲，產(chǎn)AmpC酶鮑曼不動(dòng)桿菌已有發(fā)現(xiàn)。在分析西班牙一所醫(yī)院暴發(fā)的鮑曼不動(dòng)桿菌感染中，發(fā)現(xiàn)染色體上攜帶有AmpC基因編碼的PI(>8)為9.4的［8］。該酶由1,152　bp開(kāi)放閱讀框架編碼383個(gè)氨基酸組成，與溫和氣單胞、粘質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌產(chǎn)生的AmpC酶和CMY1、FOX2、FOX3酶有40.5%~42.3%的相同；與大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、費(fèi)勞地枸櫞酸桿菌產(chǎn)生的AmpC酶有35%~40%相同。同時(shí)其氨基酸序列與C類頭孢菌素酶密切相關(guān)，而且該酶可被舒巴坦、他唑巴坦適量抑制，被克拉維酸很微弱抑制。因?yàn)樵贏mpC基因上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AmpR基因，用誘導(dǎo)劑（頭孢西?。┱T導(dǎo)后并無(wú)酶量的增加，所以該AmpC酶為非誘導(dǎo)酶。像其他C類β內(nèi)酰胺酶一樣，該AmpC酶對(duì)水解頭孢噻肟的效率比氨芐西林強(qiáng)，也可適量地水解頭孢呋辛和頭孢西丁，但對(duì)頭孢噻肟和亞胺培南的水解活性非常弱［9］。然而過(guò)量表達(dá)對(duì)青霉素類、三代頭孢霉素類都有較強(qiáng)的水解作用。從本文可知：產(chǎn)AmpC酶鮑曼不動(dòng)桿菌在我院多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌中普遍存在,這在我國(guó)尚首次報(bào)道，由于其過(guò)量表達(dá)，表現(xiàn)為對(duì)β內(nèi)酰胺酶的水解活性，尤其可水解三代頭孢菌素。同時(shí)該AmpC酶為非誘導(dǎo)酶，所以給臨床治療帶來(lái)因難，需要引起臨床足夠重視。三維試驗(yàn)檢測(cè)一株菌AmpC酶陰性，而檢出AmpC基因?yàn)殛?yáng)性，可能為低產(chǎn)酶不易檢出所致。可見(jiàn)，三維試驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)β 內(nèi)酰胺酶有一定的局限性，值得臨床實(shí)驗(yàn)室注意?！　?0世紀(jì)90年代早期開(kāi)始，在日本和歐洲就相繼發(fā)現(xiàn)依賴于鋅離子的IMP、VIM型金屬β內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和腸桿菌科細(xì)菌，可以耐受碳青霉烯類抗生素。金屬β內(nèi)酰胺酶多以質(zhì)粒插入到整合子上進(jìn)行傳播的［10］。盡管有3株菌有協(xié)同試驗(yàn)檢出為MBL陽(yáng)性，但并未檢測(cè)出相關(guān)基因，可能為其他型MBL，或是協(xié)同試驗(yàn)不確定性所致；2株藥敏結(jié)果對(duì)亞胺培南耐藥的細(xì)菌也未檢測(cè)到MBL，可能為其他碳青霉烯酶，有待進(jìn)一步分析。　　由此可見(jiàn)，我院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)β內(nèi)酰胺類的耐藥機(jī)制主要是同時(shí)產(chǎn)TEM型廣譜酶和高產(chǎn)AmpC酶以及產(chǎn)blaPER1型ESBLs所致，是否有其他耐藥機(jī)制的并存，我們將繼續(xù)研究?！　⒖嘉墨I(xiàn):　?。?］StéphaneC,NathalieC,EricE,etal.AmpCcephalosporinasehyperproductioninAciobacterbaumanniiclinicalstrains［J］.JAntimicrobChemother,2003，52：629635.　?。?］GermánB,GonzaloC,M.AngelesD,etal.CharacterizationofanosoialoutbreakCausedbyaMultiresistantAciobacterbaumanniistrainhydrolyzingEnzyme:highlevelcarbapenemresistance inA.baumanniiisnotduesolelytothepresenceofβLactamases［J］.JClinMicrobiol,2000,38:32993305.　　［3］CoudronPE，MolandES，ThomosonKS.OccurrenceanddetectionofAmpCbetalactamasesamongEscherichiacoli，KlebsiellaPneumoniae，andProteusmirabilisisolatesataveteran'smedicalcenter［J］.JClinMicrobiol，2000，38:17911996.　?。?］吳偉元，陳民鈞，王輝.陰溝腸桿菌去阻遏持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶和超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的檢測(cè)［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2001，17（2）：914.　?。?］K.Lee,Y.S.Lim,D.Yong,etal.EvaluationoftheHodgeTestandtheImipenemEDTADoubleDiskSynergyTestforDifferentiatingMetalloβLactamaseProducingIsolatesofPseudomonasspp.andAciobacterspp［Ｊ］.JClinMicrobiol,2003,41:46234629.　　［6］黃支密，陳榆，毛培華，等.鮑蔓不動(dòng)桿菌耐藥性及β內(nèi)酰胺酶基因型研究［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，11：683685.　?。?］VahabogluH,OzturkR,AygunG,et 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