越桔原花青素對新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響

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1、越桔原花青素對新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響沈楠，王艷春，任曠，顧饒勝，范紅艷【關(guān)鍵詞】原花青素類;心?。怀衫w維細(xì)胞;一氧化氮;一氧化氮合酶0引言原花青素(procyanidin，PC)是越桔重要的生物活性成分，是表兒茶素和表沒食子兒茶素的低聚體或多聚體.有研究〔1-3〕發(fā)現(xiàn)，PC具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老及抗炎癥等作用，但對越桔PC藥理活性的相關(guān)研究還少見報道.本研究以血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞(CFb)增殖，觀察越桔PC對CFb誘導(dǎo)型一氧化氮合酶一氧化氮(iN0SNO)系統(tǒng)的影響，以探討PC抑制CFb增殖的初步機(jī)制.1材料和方法1.1材料TT（美國

2、Sigma公司）；IMDM，血清（GIBCO公司）；iNOS一抗（Santacruz公司）;胰蛋白酶（寶泰克生物科技公司）;羥脯氨酸試劑盒，iNOS試劑盒（南京建成生物工程公司）;TGFβ1ELISA試劑盒（晶美生物工程有限公司）；NO試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；SP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）；FITC羊抗兔Ig（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）.1.2方法1.2.1細(xì)胞分離與培養(yǎng)DM培養(yǎng)基重懸沉淀制成細(xì)胞懸液,接種培養(yǎng)瓶中,置37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).用差速貼壁法去除內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞.實驗采用第3～5代細(xì)胞.1.2.2實驗分組與處理CFb細(xì)胞分

3、為：對照組，模型組，PC藥物治療組.各組細(xì)胞無血清培育24h后，除對照組外均給予終濃度為1×10-7mol/L的AngⅡ，藥物治療組同時給予PC，終濃度分別為25，50，100mg/L，對照組給予10mL/L血清的IMDM培養(yǎng)基.1.2.3MTT法檢測將CFb以1×108/L個細(xì)胞密度接種于96孔板,每孔200μL.分別給予不同的處理因素作用48h.每孔加入MTT溶液（5g/L）20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，每孔加入150μLDMSO，震蕩10min后，酶標(biāo)儀490nm波長處，測吸光度(A)值，以（各實驗組A值/對照組A值）×100%表示細(xì)胞增殖率.1.2.4TG

4、Fβ1蛋白及膠原含量測定各因素處理后，分別在培養(yǎng)的24和48h吸取細(xì)胞上清液，按照試劑盒操作說明測定TGFβ1蛋白含量及膠原含量.1.2.5NO含量、iNOS活性測定各處理因素與CFb共孵育6h.檢測細(xì)胞上清夜中NO含量及iNOS活性的變化.實驗操作按NO,iNOS試劑盒說明書進(jìn)行.1.2.6免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色將CFb加入到預(yù)先放置蓋玻片的24孔板，各因素作用6h.將生長有CFb的蓋玻片取出，PBS洗滌3次，40g/L多聚甲醛固定30min,山羊血清室溫封閉30min；滴加一抗（兔抗大鼠,1∶50稀釋）4℃過夜;PBS洗3次;再滴加FITC標(biāo)記的二抗(羊抗兔),37℃

5、1h,PBS洗15min×3次;觀察并拍照.用ImageProPlus圖像分析軟件（MediaCyberics公司）檢測平均吸光度值.統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用方差分析及q檢驗進(jìn)行.P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.1PC對CFb增殖、膠原代謝及TGFβ1的影響與對照組相比較，AngⅡ模型組細(xì)胞增殖率、羥脯氨酸含量、TGFβ1含量均有增加（P0.01）.PC在25，50，100mg/L劑量時可抑制細(xì)胞增殖；降低羥脯氨酸及TGFβ1含量；與AngⅡ模型組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05或P0.01，表1）.2.2PC對iNOS蛋白表達(dá)、

6、活性及NO含量的影響對照組CFb具有iNOS蛋白表達(dá)及活性,能夠合成NO.AngⅡ模型組CFbiNOS蛋白表達(dá)減少、活性降低,NO的含量減少，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01).各PC藥物治療組均可增強(qiáng)CFb的蛋白表達(dá)及活性，提高NO含量，與AngⅡ模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05，表1）.表1原花青素對CFb增殖、膠原代謝、TGFβ1及iN0SNO系統(tǒng)的影響3討論心肌纖維化是以心臟間質(zhì)CFb過度增殖和膠原過度沉積為特征的心臟間質(zhì)重構(gòu).研究〔2-3〕表明，AngⅡ可通過刺激CFb分泌TGFβ1而促進(jìn)膠原生成.本研究以AngⅡ作用于CFb構(gòu)建心肌纖維化

7、的細(xì)胞模型，實驗結(jié)果顯示：PC可降低AngⅡ誘導(dǎo)的CFbA值增高，TGFβ1增加，羥脯氨酸含量增多，表明PC可抑制心肌纖維化的發(fā)生.NO是調(diào)節(jié)心肌纖維化的重要活性物質(zhì)，它的生物合成受NOS調(diào)節(jié).體內(nèi)NOS分為結(jié)構(gòu)型NOS（cNOS）和誘導(dǎo)型NOS(iNOS).免疫組化研究〔4〕發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞中只有iNOS，即CFb具有內(nèi)源性iNOSNO系統(tǒng).CFb合成的NO通過與鐵硫基團(tuán)中鐵發(fā)生配位結(jié)合,抑制非血紅素鐵硫酶,干擾能量代謝和DNA合成；也可激活鳥苷酸環(huán)化酶從而抑制Ca2+內(nèi)流,最終抑制細(xì)胞增殖和膠原合成〔5