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《杜仲水-醇提取物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、杜仲水/醇提取物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響：張艷紅謝煥松夏樹(shù)林趙春譚湘陵【摘要】目的觀察杜仲水提取物和醇提取物對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)成骨分化的影響。方法SD大鼠骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)并傳代3次后進(jìn)行成骨化誘導(dǎo)，誘導(dǎo)物分為水/醇提取物的102、103、104和1054個(gè)稀釋度。誘導(dǎo)6d后，測(cè)定細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性，14d后水溶性茜素紅S染色法鈣化測(cè)定結(jié)節(jié)形成。結(jié)果杜仲水/醇提取物對(duì)MSCs的增殖活力均無(wú)明顯影響，對(duì)ALP活力均有上調(diào)作用。水/醇提取物在103到105稀釋度下，對(duì)鈣化結(jié)節(jié)的形成具有顯著刺激作用，醇提取物對(duì)
2、ALP活性和鈣化結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)作用大于水提取物。結(jié)論杜仲水/醇提取物能促進(jìn)骨髓MSCs成骨分化，醇提取物的作用大于水提取物?！娟P(guān)鍵詞】杜仲;大鼠;間充質(zhì)干細(xì)胞;成骨分化 骨質(zhì)疏松(OP)的發(fā)病機(jī)制涉及眾多方面，其中成骨細(xì)胞(OB)和破骨細(xì)胞(OC)的功能失調(diào)已為學(xué)術(shù)界所公認(rèn)。杜仲是傳統(tǒng)中藥，具有“補(bǔ)益肝腎,堅(jiān)筋骨,輕身耐老”的功效，已有許多學(xué)者在杜仲防治OP和調(diào)節(jié)OB等方面做了探究〔1~4〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是OB的，MSCs經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程后分化為成熟的OB。杜仲對(duì)MSCs分化影響的研究很少，目前僅有梁翔等〔5〕人的報(bào)道。杜仲有藥理作用的成分
3、很多〔6〕，并且用不同的方法提取后所得的活性成分也不相同〔7〕，但杜仲不同提取物對(duì)MSCs的直接作用尚未明了，本文應(yīng)用MSCs培養(yǎng)體系，觀察杜仲的水提取物和醇提取物對(duì)MSCs成骨 分化的影響。 1材料與方法 1.1杜仲水/醇提取物制備鹽杜仲(江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，1g/包，生產(chǎn)批號(hào)：070316)2g，分別加蒸餾水或甲醇至15ml，室溫震蕩1h，靜置過(guò)夜后，15000r/min離心10min，棄沉淀。水浸上清不經(jīng)處理即得水提取物;甲醇浸上清經(jīng)真空濃縮，再加水至15ml溶解后得醇提取物。水/醇提取物均經(jīng)0.22μm膜過(guò)濾，-20℃保存。 1.2
4、大鼠MSCs培養(yǎng)2月齡SD大鼠(雌雄不拘)頸椎脫位處死，解剖取股骨和脛骨，去盡軟組織后，用培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml后，置含20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞狀況換液，細(xì)胞融合至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，傳代3次后進(jìn)行成骨化誘導(dǎo)?！ ?.3誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)接種到96孔和24孔培養(yǎng)板中，24h后棄去原有的培養(yǎng)基更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DMEM/F12中分別含102、103、104和1054個(gè)稀釋度的杜仲水/醇提取物;對(duì)照組按照提取物的加入量加入磷酸鹽緩沖液
5、(PBS)，細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)重復(fù)組，其余實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)重復(fù)組?！ ?.4MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活力細(xì)胞誘導(dǎo)分化6d后，于96孔培養(yǎng)板中每孔加入20μlMTT溶液，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，吸去上清液后，每孔加入150μl二甲基亞砜，搖床振蕩10min，溶解結(jié)晶，在ELX-800酶標(biāo)儀上以490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光值?！ ?.5細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定細(xì)胞誘導(dǎo)分化6d后取出24孔培養(yǎng)板，胰酶消化分別收集每孔的細(xì)胞，1500r/min離心5min，去上清，用少量的PBS懸浮沉淀后，涂片。采用上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司ALP染色液試劑盒測(cè)定ALP活性，鏡
6、下觀 察染色結(jié)果，任意視野計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，每孔至少計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞?！ ?.6細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)測(cè)定細(xì)胞誘導(dǎo)14d后，棄去24孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，甲醛∶甲醇∶水(1∶1∶1.5)固定15min，1%茜素紅S染色20min，水洗若干次，室溫干燥后，鏡下觀察每孔鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量、體積及染色強(qiáng)度。 1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以x±s表示,用單因素方差分析進(jìn)行組間比較?！ ?結(jié)果 2.1MTT法測(cè)定結(jié)果各誘導(dǎo)組OD490值與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(水提物F=2.01,醇提物F=1.5,F0.05=2.76,均P>0.05)，說(shuō)明杜仲水/醇提取物對(duì)
7、大鼠MSCs的增殖活力均無(wú)明顯影響。見(jiàn)表1。 2.3鈣化結(jié)節(jié)測(cè)定結(jié)果鏡下觀察，對(duì)照組未見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)，102稀釋度的水/醇提取物鈣化結(jié)節(jié)不明顯。醇提取物在103、104和105稀釋度下，對(duì)細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的形成具有顯著刺激作用，水提取物在103、104和105稀釋度下，也具有類似作用，但不如醇提取物明顯。見(jiàn)圖1。表1不同稀釋度杜仲水/醇提物對(duì)細(xì)胞增殖的影響表2不同稀釋度杜仲水/醇提物對(duì)細(xì)胞ALP活性 的影響圖1鈣化結(jié)節(jié)(×40) 3討論 MSCs具有分化為多種細(xì)胞的潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下可向著OB或脂肪細(xì)胞分化〔8〕，因而利用體外培養(yǎng)的MSCs研究促分
8、化誘導(dǎo)物的作用，具有周期短、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好和結(jié)果可靠的特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，杜仲
