玻璃粘連蛋白對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響

《玻璃粘連蛋白對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、玻璃粘連蛋白對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響：王明明葉發(fā)剛葛銀林【摘要】目的體外分離純化培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rMSC），研究玻璃粘連蛋白（VN）在rMSC向成骨方向分化過程中的作用。方法貼壁分離培養(yǎng)法分離純化rMSC，觀察第1、3、5、8、10代細(xì)胞的增殖情況，并繪制出生長曲線。選第3代細(xì)胞用以VN包被的培養(yǎng)板培養(yǎng)，每4d檢測堿性磷酸酶活性及鈣結(jié)節(jié)的形成。結(jié)果經(jīng)貼壁篩選法分離的rMSC生長曲線呈S形，第3、4、5代細(xì)胞排列具有典型的漩渦狀結(jié)構(gòu)；細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90，而不表達(dá)CD34。用以VN包被的培養(yǎng)板培養(yǎng)12d，堿性磷酸酶染色呈陽性，硝酸銀染色顯示有鈣結(jié)節(jié)形成。結(jié)論VN

2、有誘導(dǎo)rMSC向成骨方向分化的作用?！娟P(guān)鍵詞】骨髓;間質(zhì)干細(xì)胞；玻璃粘連蛋白;細(xì)胞分化　　［ABSTRACT］ObjectiveToisolate,purifyandcultivatetheratmesenehymalstemcells(rMSCs)invitro,andstudytheeffectofvitronectin(VN)onosteogenicdifferentiationofrMSCs.MethodsrMSCs,and3rd,4thand5thgenerationmanifestedastypicalarroesenchymalstemcells;vitronectin;

3、celldifferentiation骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）為骨髓中一群多能干細(xì)胞，在不同的因素誘導(dǎo)下可以分化為不同的細(xì)胞。啟動MSC分化的確切因素尚不十分清楚，周圍環(huán)境中某些可溶性誘導(dǎo)因子已被成功鑒定，而周圍不可溶性成分對成骨誘導(dǎo)的作用相對關(guān)注較少。本實(shí)驗(yàn)主要研究構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的玻璃粘連蛋白（VN）在MSC向成骨分化過程中的作用，以探討MSC成骨分化的確切因素?！　?材料和方法　　1.1實(shí)驗(yàn)材料EM低糖培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(SIGMA公司)，羊抗大鼠CD34FITC、CD44FITC、CD90FITC（北京中山生物

4、公司）。　　1.2實(shí)驗(yàn)方法　　1.2.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rMSC）的體外分離培養(yǎng)　　取2月齡EM沖出骨髓，離心去除上清及脂肪，所得細(xì)胞懸液以1.0×108/L的細(xì)胞密度接種于75mL培養(yǎng)瓶中，在含體積分?jǐn)?shù)0.15胎牛血清LDMEM完全培養(yǎng)液中，37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，3d后首次換液，去除未貼壁細(xì)胞。以后每2～3d換液1次，待貼壁細(xì)胞融合90%時，以2.5g/L胰蛋白酶消化、傳代。貼壁細(xì)胞融合90%時即傳代1次，傳至第3代時進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?！　?.2.2rMSC的生長曲線繪制　　分別取第1、3、5、8、10代細(xì)胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化后加入LDMEM

5、完全培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×107/L，接種于5個24孔板，每孔加細(xì)胞懸液1.0mL。每天每板取3孔消化，制成細(xì)胞懸液，混勻，計數(shù)并取平均值，連續(xù)9d，以時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。　　1.2.3rMSC的鑒定　?、傩螒B(tài)學(xué)觀察:在倒置顯微鏡下定期觀察細(xì)胞生長情況。②細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定:取第3代細(xì)胞消化、計數(shù)、離心，加入200μLPBS制成細(xì)胞懸液。設(shè)置陰性對照，加入羊IgG1FITC;其他管分別加羊抗大鼠CD34FITC、CD44FITC、CD90FITC以及細(xì)胞與熒光素共軛抗體抗CD29、CD34、CD90，在黑暗中孵化15min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗

6、原表達(dá)情況?！　?.2.4rMSC與VN共培養(yǎng)及相關(guān)指標(biāo)檢測　　在rMSC傳代3次后，將指數(shù)生長期細(xì)胞用LDMEM調(diào)細(xì)胞的密度為3.0×103/cm2，接種于用純化的VN包被的24孔培養(yǎng)板中，以成骨誘導(dǎo)液為陽性對照，以含體積分?jǐn)?shù)0.15胎牛血清LDMEM完全培養(yǎng)液為陰性對照，每3d換液1次，在培養(yǎng)至4、8、12和16d時分別進(jìn)行堿性磷酸酶染色和鈣離子沉淀測定。堿性磷酸酶染色：向培養(yǎng)板中加入雙蒸水配制的萘酚ASMX磷酸鹽和FastblueRR溶液，孵育，顯微鏡下測定染料沉積情況。鈣離子沉淀的測定：用30g/L的多聚甲醛固定細(xì)胞30min，雙蒸水洗2次，暗處與50g/L的硝酸銀溶液孵

7、育10min，雙蒸水洗后暴露于強(qiáng)光下1h，計數(shù)染色細(xì)胞沉積顆粒的數(shù)目和大小。　　2結(jié)果原代培養(yǎng)細(xì)胞12h可見細(xì)胞貼壁，3d后大部分細(xì)胞貼壁，第1次換液后細(xì)胞4h貼壁，細(xì)胞呈多角形、菱形，可見集落形成;9～10d細(xì)胞間相互融合達(dá)90%。傳代后細(xì)胞4h貼壁，生長迅速，細(xì)胞呈較為均一的梭形、多角形，并呈漩渦狀排布。rMSC生長曲線呈S形，第3～5代增殖迅速，1代和8代次之，10代生長明顯減慢（圖1）。分離純化的細(xì)胞不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD34，而強(qiáng)