免疫層析法測定動物源性食品中磺胺嘧啶殘留

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1、免疫層析法測定動物源性食品中磺胺嘧啶殘留作者：王喜亮金秀娥李奎熊寧石德時畢丁仁【摘要】建立了動物源性食品中磺胺嘧啶殘留的免疫層析快速測定方法。用膠體金標記磺胺嘧啶單克隆抗體作為顯色劑，磺胺嘧啶競爭物包被于硝酸纖維素層析膜上作為捕獲試劑，采用競爭反應模式制成膠體金免疫層析試紙。該免疫層析試紙可以在15min內(nèi)完成對磺胺嘧啶殘留的半定量檢測。讀條系統(tǒng)判定靈敏度為5ng/ml，肉眼判定檢測限靈敏度為10ng/ml，與其它磺胺類藥物無交叉反應。該方法在不同動物源性食品(雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉、豬肝、牛奶、蜂蜜)中添加磺胺嘧啶的回收率在68.

2、1%～118.8%范圍內(nèi)。動物試驗樣品檢測結果表明，該方法與ELISA及HPLC具有好的符合率。該方法靈敏度高,檢測準確、簡便、快速，有良好的開發(fā)應用前景?！娟P鍵詞】膠體金；免疫層析；磺胺嘧啶ABSTRACTAnimmunochromatographicassay(ICA)alorigin.Basedonthepetitivereactionmechanism,thepetitorofsulfadiazineembranesactedasthecapturereagent.Colloidalgoldonoclonalantibody

3、againstsulfadiazineservedasthedetectionreagent.RLs)為0.1mg/kg。目前檢測磺胺嘧啶殘留的常用方法主要是高效液相色譜法(HPLC)［2，3］和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)［4，5］，該方法靈敏、準確，但需要昂貴的設備，需要專業(yè)人員操作，而且操作煩瑣，檢測時間長，成本高，推廣使用受到一定限制。免疫層析方法是一種新型的檢測方法，具有簡便、快速、準確、費用低和不需要專業(yè)人員操作等優(yōu)點，適用于免疫學領域中的快速檢測分析。目前，該方法已被應用于藥物殘留分析［6～8］。針對磺胺嘧啶殘留檢測

4、方法存在的缺陷及免疫層析方法的優(yōu)點，在本研究中我們利用免疫層析方法實現(xiàn)了動物源性食品中磺胺嘧啶殘留的的快速檢測。1材料與方法1.1主要材料冷凍離心機，HITACHI公司；ZX1000點膜儀，CM4000切條機，TSR3000讀條系統(tǒng)，BioDot公司；抗SD單克隆抗體，本實驗室保存；羊抗鼠IgG，華美生物工程公司；磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲口惡唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹口惡啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、克倫特羅、氯金酸(HAuCl4·4H2O)，Sigma公司產(chǎn)品；氯霉素，中國藥品生物制品檢定所；硝酸纖維素膜、玻璃纖維，

5、Millipore公司產(chǎn)品；磺胺嘧啶殘留ELISA檢測試劑盒，RANDOX公司；高效液相系統(tǒng)，l，攪拌狀態(tài)下加熱至沸騰，加入1%的檸檬酸三鈉2ml，攪拌加熱15min，室溫冷卻后，放置4℃存放。(4)金標抗體的制備10ml膠體金，用0.1mol/LK2CO3溶液調(diào)其pH至8.0，在攪拌狀態(tài)下，加入一定量的抗SD單抗100μg(將磺胺嘧啶單抗?jié)舛日{(diào)整到1mg/ml)，混勻，放置30min，加入2.5ml5%的BSA，混勻，4℃放置1h，4℃12000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用pH9.0的硼酸緩沖液溶解至10ml；重復離

6、心洗滌兩次，沉淀用pH9.0的硼酸緩沖液稀釋至1ml。用點膜儀將其均勻的噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后，密封備用。(5)免疫層析試紙的制備免疫層析試紙由吸樣材料、玻璃纖維、硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水材料和含雙面膠的白色塑料板組成(圖1A)。用點膜儀在玻璃纖維上噴涂金標抗SD單抗作為顯色劑；在NC膜上包被羊抗鼠IgG和BSASD，分別作為對照線(C)和檢測線(T)。將吸樣材料、玻璃纖維、NC膜、吸水材料依次粘在白色塑料板上，用切條機切成寬3mm的小條制成免疫層析試紙。(6)免疫層析試紙的檢測原理將試紙插入樣品液中，樣品在毛細管作用下

7、向上泳動，當泳動至玻璃纖維時，固態(tài)化的金標抗SD單抗迅速溶解釋放，一起向前泳動至T線，若樣品中不含SD，金標抗SD單抗與包被于NC膜上的BSASD發(fā)生特異性免疫反應而被截獲，在T線形成紅色條帶，部分金標單抗穿過T線被包被于C線的羊抗鼠IgG截獲，形成紅色條帶(圖1B)；反之，若樣品中含有SD，SD首先與金標抗SD單抗發(fā)生免疫反應，抑制其與T線的SDBSA的結合，使T線截獲的金標抗體的量減少，T線顏色變淺，部分金標單抗或其復合物穿過T線被C線截獲，形成紅色條帶(圖1C)；T線顏色的深淺與樣品中SD的含量成負相關，當樣品中SD的量足

8、夠大時，T線將無顏色出現(xiàn)，C線出現(xiàn)紅色條帶(圖1D)。(7)樣品預處理雞蛋樣品將雞蛋樣品勻漿，取2g樣品加入4ml乙酸乙酯上、下振蕩3min，室溫5000r/min離心5min，取300μl上層液體80℃水浴蒸干或在氮氣流下吹干，用1