免疫層析法測定動物源性食品中磺胺嘧啶殘留

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1、免疫層析法測定動物源性食品中磺胺嘧啶殘留王喜亮金秀娥李奎熊寧石德時畢丁仁【摘要】建立了動物源性食品中磺胺嘧啶殘留的免疫層析快速測定方法。用膠體金標(biāo)記磺胺嘧啶單克隆抗體作為顯色劑，磺胺嘧啶競爭物包被于硝酸纖維素層析膜上作為捕獲試劑，采用競爭反應(yīng)模式制成膠體金免疫層析試紙。該免疫層析試紙可以在15min內(nèi)完成對磺胺嘧啶殘留的半定量檢測。讀條系統(tǒng)判定靈敏度為5ng/ml，肉眼判定檢測限靈敏度為10ng/ml，與其它磺胺類藥物無交叉反應(yīng)。該方法在不同動物源性食品(雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉、豬肝、牛奶、蜂蜜)中添加磺胺嘧啶的回收率在68.

2、1%～118.8%范圍內(nèi)。動物試驗(yàn)樣品檢測結(jié)果表明，該方法與ELISA及HPLC具有好的符合率。該方法靈敏度高,檢測準(zhǔn)確、簡便、快速，有良好的開發(fā)應(yīng)用前景?！娟P(guān)鍵詞】膠體金；免疫層析；磺胺嘧啶ABSTRACTAnimmunochromatographicassay(ICA)alorigin.Basedonthepetitivereactionmechanism,thepetitorofsulfadiazineembranesactedasthecapturereagent.Colloidalgoldonoclonalantib

3、odyagainstsulfadiazineservedasthedetectionreagent.RLs)為0.1mg/kg。目前檢測磺胺嘧啶殘留的常用方法主要是高效液相色譜法(HPLC)〔2，3〕和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)〔4，5〕，該方法靈敏、準(zhǔn)確，但需要昂貴的設(shè)備，需要專業(yè)人員操作，而且操作煩瑣，檢測時間長，成本高，推廣使用受到一定限制。免疫層析方法是一種新型的檢測方法，具有簡便、快速、準(zhǔn)確、費(fèi)用低和不需要專業(yè)人員操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于免疫學(xué)領(lǐng)域中的快速檢測分析。目前，該方法已被應(yīng)用于藥物殘留分析〔6～8〕。針對磺胺

4、嘧啶殘留檢測方法存在的缺陷及免疫層析方法的優(yōu)點(diǎn)，在本研究中我們利用免疫層析方法實(shí)現(xiàn)了動物源性食品中磺胺嘧啶殘留的的快速檢測。1材料與方法1.1主要材料冷凍離心機(jī)，HITACHI公司；ZX1000點(diǎn)膜儀，CM4000切條機(jī)，TSR3000讀條系統(tǒng)，BioDot公司；抗SD單克隆抗體，本實(shí)驗(yàn)室保存；羊抗鼠IgG，華美生物工程公司；磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲口惡唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹口惡啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、克倫特羅、氯金酸(HAuCl4·4H2O)，Sigma公司產(chǎn)品；氯霉素，中國藥品生物制品檢定所；硝酸纖

5、維素膜、玻璃纖維，Millipore公司產(chǎn)品；磺胺嘧啶殘留ELISA檢測試劑盒，RANDOX公司；高效液相系統(tǒng)，l，攪拌狀態(tài)下加熱至沸騰，加入1%的檸檬酸三鈉2ml，攪拌加熱15min，室溫冷卻后，放置4℃存放。(4)金標(biāo)抗體的制備10ml膠體金，用0.1mol/LK2CO3溶液調(diào)其pH至8.0，在攪拌狀態(tài)下，加入一定量的抗SD單抗100μg(將磺胺嘧啶單抗?jié)舛日{(diào)整到1mg/ml)，混勻，放置30min，加入2.5ml5%的BSA，混勻，4℃放置1h，4℃12000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用pH9.0的硼酸緩沖

6、液溶解至10ml；重復(fù)離心洗滌兩次，沉淀用pH9.0的硼酸緩沖液稀釋至1ml。用點(diǎn)膜儀將其均勻的噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后，密封備用。(5)免疫層析試紙的制備免疫層析試紙由吸樣材料、玻璃纖維、硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水材料和含雙面膠的白色塑料板組成(圖1A)。用點(diǎn)膜儀在玻璃纖維上噴涂金標(biāo)抗SD單抗作為顯色劑；在NC膜上包被羊抗鼠IgG和BSASD，分別作為對照線(C)和檢測線(T)。將吸樣材料、玻璃纖維、NC膜、吸水材料依次粘在白色塑料板上，用切條機(jī)切成寬3mm的小條制成免疫層析試紙。(6)免疫層析試紙的檢測原理將試紙插

7、入樣品液中，樣品在毛細(xì)管作用下向上泳動，當(dāng)泳動至玻璃纖維時，固態(tài)化的金標(biāo)抗SD單抗迅速溶解釋放，一起向前泳動至T線，若樣品中不含SD，金標(biāo)抗SD單抗與包被于NC膜上的BSASD發(fā)生特異性免疫反應(yīng)而被截獲，在T線形成紅色條帶，部分金標(biāo)單抗穿過T線被包被于C線的羊抗鼠IgG截獲，形成紅色條帶(圖1B)；反之，若樣品中含有SD，SD首先與金標(biāo)抗SD單抗發(fā)生免疫反應(yīng)，抑制其與T線的SDBSA的結(jié)合，使T線截獲的金標(biāo)抗體的量減少，T線顏色變淺，部分金標(biāo)單抗或其復(fù)合物穿過T線被C線截獲，形成紅色條帶(圖1C)；T線顏色的深淺與樣品中S

8、D的含量成負(fù)相關(guān)，當(dāng)樣品中SD的量足夠大時，T線將無顏色出現(xiàn)，C線出現(xiàn)紅色條帶(圖1D)。(7)樣品預(yù)處理雞蛋樣品將雞蛋樣品勻漿，取2g樣品加入4ml乙酸乙酯上、下振蕩3min，室溫5000r/min離心5min，取300μl上層液體80℃水浴蒸干或在氮?dú)饬飨麓蹈?，?50μ