免疫層析法測(cè)定動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留

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1、免疫層析法測(cè)定動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留王喜亮金秀娥李奎熊寧石德時(shí)畢丁仁【摘要】建立了動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留的免疫層析快速測(cè)定方法。用膠體金標(biāo)記磺胺嘧啶單克隆抗體作為顯色劑，磺胺嘧啶競(jìng)爭(zhēng)物包被于硝酸纖維素層析膜上作為捕獲試劑，采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式制成膠體金免疫層析試紙。該免疫層析試紙可以在15min內(nèi)完成對(duì)磺胺嘧啶殘留的半定量檢測(cè)。讀條系統(tǒng)判定靈敏度為5ng/ml，肉眼判定檢測(cè)限靈敏度為10ng/ml，與其它磺胺類藥物無交叉反應(yīng)。該方法在不同動(dòng)物源性食品(雞肉、雞蛋、雞肝、豬肉、豬肝、牛奶、蜂蜜)中添加磺胺嘧啶的回收率在68.

2、1%～118.8%范圍內(nèi)。動(dòng)物試驗(yàn)樣品檢測(cè)結(jié)果表明，該方法與ELISA及HPLC具有好的符合率。該方法靈敏度高,檢測(cè)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。【關(guān)鍵詞】膠體金；免疫層析；磺胺嘧啶ABSTRACTAnimmunochromatographicassay(ICA)alorigin.Basedonthepetitivereactionmechanism,thepetitorofsulfadiazineembranesactedasthecapturereagent.Colloidalgoldonoclonalantib

3、odyagainstsulfadiazineservedasthedetectionreagent.RLs)為0.1mg/kg。目前檢測(cè)磺胺嘧啶殘留的常用方法主要是高效液相色譜法(HPLC)〔2，3〕和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)〔4，5〕，該方法靈敏、準(zhǔn)確，但需要昂貴的設(shè)備，需要專業(yè)人員操作，而且操作煩瑣，檢測(cè)時(shí)間長，成本高，推廣使用受到一定限制。免疫層析方法是一種新型的檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、費(fèi)用低和不需要專業(yè)人員操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于免疫學(xué)領(lǐng)域中的快速檢測(cè)分析。目前，該方法已被應(yīng)用于藥物殘留分析〔6～8〕。針對(duì)磺胺

4、嘧啶殘留檢測(cè)方法存在的缺陷及免疫層析方法的優(yōu)點(diǎn)，在本研究中我們利用免疫層析方法實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物源性食品中磺胺嘧啶殘留的的快速檢測(cè)。1材料與方法1.1主要材料冷凍離心機(jī)，HITACHI公司；ZX1000點(diǎn)膜儀，CM4000切條機(jī)，TSR3000讀條系統(tǒng)，BioDot公司；抗SD單克隆抗體，本實(shí)驗(yàn)室保存；羊抗鼠IgG，華美生物工程公司；磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲口惡唑、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺喹口惡啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、克倫特羅、氯金酸(HAuCl4·4H2O)，Sigma公司產(chǎn)品；氯霉素，中國藥品生物制品檢定所；硝酸纖

5、維素膜、玻璃纖維，Millipore公司產(chǎn)品；磺胺嘧啶殘留ELISA檢測(cè)試劑盒，RANDOX公司；高效液相系統(tǒng)，l，攪拌狀態(tài)下加熱至沸騰，加入1%的檸檬酸三鈉2ml，攪拌加熱15min，室溫冷卻后，放置4℃存放。(4)金標(biāo)抗體的制備10ml膠體金，用0.1mol/LK2CO3溶液調(diào)其pH至8.0，在攪拌狀態(tài)下，加入一定量的抗SD單抗100μg(將磺胺嘧啶單抗?jié)舛日{(diào)整到1mg/ml)，混勻，放置30min，加入2.5ml5%的BSA，混勻，4℃放置1h，4℃12000r/min離心30min，棄上清，將沉淀用pH9.0的硼酸緩沖

6、液溶解至10ml；重復(fù)離心洗滌兩次，沉淀用pH9.0的硼酸緩沖液稀釋至1ml。用點(diǎn)膜儀將其均勻的噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后，密封備用。(5)免疫層析試紙的制備免疫層析試紙由吸樣材料、玻璃纖維、硝酸纖維素膜(NC膜)、吸水材料和含雙面膠的白色塑料板組成(圖1A)。用點(diǎn)膜儀在玻璃纖維上噴涂金標(biāo)抗SD單抗作為顯色劑；在NC膜上包被羊抗鼠IgG和BSASD，分別作為對(duì)照線(C)和檢測(cè)線(T)。將吸樣材料、玻璃纖維、NC膜、吸水材料依次粘在白色塑料板上，用切條機(jī)切成寬3mm的小條制成免疫層析試紙。(6)免疫層析試紙的檢測(cè)原理將試紙插

7、入樣品液中，樣品在毛細(xì)管作用下向上泳動(dòng)，當(dāng)泳動(dòng)至玻璃纖維時(shí)，固態(tài)化的金標(biāo)抗SD單抗迅速溶解釋放，一起向前泳動(dòng)至T線，若樣品中不含SD，金標(biāo)抗SD單抗與包被于NC膜上的BSASD發(fā)生特異性免疫反應(yīng)而被截獲，在T線形成紅色條帶，部分金標(biāo)單抗穿過T線被包被于C線的羊抗鼠IgG截獲，形成紅色條帶(圖1B)；反之，若樣品中含有SD，SD首先與金標(biāo)抗SD單抗發(fā)生免疫反應(yīng)，抑制其與T線的SDBSA的結(jié)合，使T線截獲的金標(biāo)抗體的量減少，T線顏色變淺，部分金標(biāo)單抗或其復(fù)合物穿過T線被C線截獲，形成紅色條帶(圖1C)；T線顏色的深淺與樣品中S

8、D的含量成負(fù)相關(guān)，當(dāng)樣品中SD的量足夠大時(shí)，T線將無顏色出現(xiàn)，C線出現(xiàn)紅色條帶(圖1D)。(7)樣品預(yù)處理雞蛋樣品將雞蛋樣品勻漿，取2g樣品加入4ml乙酸乙酯上、下振蕩3min，室溫5000r/min離心5min，取300μl上層液體80℃水浴蒸干或在氮?dú)饬飨麓蹈?，?50μ