葛根素在新生鼠缺氧缺血性腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用

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1、葛根素在新生鼠缺氧缺血性腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用作者：姜泓,王玲,張義和,劉世平,劉廣忠【摘要】目的:建立新生大鼠缺氧缺血腦損傷(HIBD)模型,觀察新生鼠缺氧缺血后腦組織一氧化氮(NO)和NO合成酶(NOS)及神經(jīng)元凋亡的變化及葛根素對(duì)HIBD的保護(hù)作用及機(jī)制.方法:用7日齡SD大鼠制備HIBD模型，治療組在缺氧缺血（HI）后早期腹腔注射葛根素50mg/kg兩次.在HI后不同時(shí)間測(cè)定腦組織勻漿NO和NOS含量以及神經(jīng)元凋亡數(shù)量.結(jié)果:HIBD組在HI后24h腦組織NO，NOS明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；HI后6h海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞增多，24h達(dá)高峰；葛根素

2、組24h腦組織NO，NOS較HIBD組相比，顯著下降(P<0.05)，同時(shí)海馬CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)在24h較HIBD組明顯減少(P<0.05).結(jié)論:葛根素可通過(guò)抑制NOS的表達(dá)，減少NO的過(guò)量生成，從而減輕HIBD后的神經(jīng)元凋亡，表明葛根素對(duì)新生大鼠HIBD有保護(hù)作用.【關(guān)鍵詞】葛根素;一氧化氮;一氧化氮合成酶;神經(jīng)元凋亡;缺氧缺血;新生鼠0引言新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）是新生兒期的常見(jiàn)病,是導(dǎo)致死亡和兒童神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因之一，目前尚缺乏特效治療方法.葛根素為豆科葛屬植物野葛干燥根中提取的異黃酮類的主要有效成分之一，在成人的腦血管疾病治療中療效

3、顯著，但在HIE時(shí)的作用鮮見(jiàn)報(bào)道.本研究通過(guò)建立新生大鼠缺氧缺血模型，觀察大鼠腦缺氧缺血后腹腔內(nèi)注射葛根素對(duì)腦組織NO和NOS含量及神經(jīng)元凋亡的影響,以探討葛根素在HIE中的作用與機(jī)制.1材料和方法1．1材料新生7d齡SD大鼠48只，體質(zhì)量12~16g，二級(jí)動(dòng)物，雌雄不限，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.葛根素注射液購(gòu)自山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，NO及NOS試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（德國(guó)ROCHE公司生產(chǎn)）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，缺氧艙及氧濃度監(jiān)測(cè)儀由第四軍醫(yī)大學(xué)航空醫(yī)學(xué)系提供.1．2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將48只新生大鼠

4、隨機(jī)分為3組：①葛根素治療組：于缺氧缺血后即刻、4h腹腔注射葛根素50mg/kg.②缺氧缺血性腦損傷組(HIBD)：于缺氧缺血后即刻、4h腹腔注射等量生理鹽水.③假手術(shù)對(duì)照組：僅作頸部切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎，于手術(shù)后即刻、4h腹腔注射等量生理鹽水.1.2.2新生大鼠HIBD模型的建立以5g/L的氯胺酮麻醉，取仰臥位固定于手術(shù)板上.采取頸正中偏右2~3mm切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，用50絲線結(jié)扎、縫合切口后，恢復(fù)2h置于2000mL常溫常壓缺氧艙，以1.5L/min的速度輸入含80mL/L氧氣和920mL/L氮?dú)獾幕旌蠚怏w，以測(cè)氧儀監(jiān)控氧的濃度為(80±5)m

5、L/L,2h后取出，返回母鼠身邊繼續(xù)哺乳喂養(yǎng).1.2.3腦組織標(biāo)本的留取于腦缺氧缺血后6h,24h分別麻醉后斷頭取腦并矢狀離斷為左右半球.1.2.4腦組織勻漿的制備及NO,NOS的檢測(cè)取部分右腦組織漂洗、去除血漬、稱重，按1∶9的比例加入冷生理鹽水，在玻璃勻漿管中充分研碎致勻漿化，取100mL/L腦組織勻漿3500r/min離心10min,取上清液檢測(cè)NO,NOS.具體操作按試劑盒說(shuō)明.1.2.4石蠟切片的制備及細(xì)胞凋亡檢測(cè)斷頭后，立即取出部分右腦組織置于中性甲醛（pH7.2~7.4的磷酸緩沖液PBS為溶劑的甲醛）中常溫固定24h，自丘腦中1／3平面行冠狀切片，厚約4

6、mm，依次脫水、浸蠟、包埋，切片厚度約6μm,HE染色，光鏡下觀察確定海馬位置，臨近處的石蠟標(biāo)本連續(xù)切片.切片放入65℃的烤片機(jī)上6h，取出后放入4℃冰箱待用.原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將組織切片依次脫蠟至水后，進(jìn)行TUNEL染色，觀察400倍光鏡5個(gè)視野下平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，具體操作步驟按試劑盒中的說(shuō)明書進(jìn)行（選用蛋白酶K通透處理）.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用LSDt檢驗(yàn).2結(jié)果2.1NO，NOS的變化HIBD在HI后6h腦勻漿NO,NOS水平開(kāi)始升高，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；24h腦勻漿NO，NOS水

7、平明顯增高，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；而葛根素治療組24h腦勻漿NO，NOS水平顯著低于HIBD，兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05,表1）.2.2HE染色和TUNEL染色假手術(shù)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織切片無(wú)明顯缺氧缺血改變.HIBD組6h缺氧缺血側(cè)海馬組織輕度水腫，可見(jiàn)神經(jīng)元腫脹、變性、空泡形成，核固縮，嗜堿性增強(qiáng)，核仁消失，并可見(jiàn)到凋亡小體；24h細(xì)胞凋亡達(dá)高峰，并見(jiàn)許多壞死細(xì)胞，嗜伊紅深染（圖1）.HIBD組各時(shí)間點(diǎn)其缺氧缺血側(cè)細(xì)胞核內(nèi)均可觀察到凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征為胞體縮小，細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)凝集，密度增高，