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《monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的pcr分析論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、Monascusruber5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析論文【關(guān)鍵詞】洛伐他汀合成酶合成酶摘要:目的分析Monascusruber5031洛伐他汀合成酶基因的結(jié)構(gòu)。方法用3對(duì)以土曲霉洛伐他汀合成酶基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)的PCR引物對(duì)紅曲霉基因組進(jìn)行了PCR分析，其中一對(duì)引物序列為，正向：5’TTCGATGCGGCCTTCTTCAAT3’和反向5’ATGGTTCGGCATCGTAATTCC3’。結(jié)果在紅曲霉基因組中相當(dāng)于土曲霉洛伐他汀合成酶基因的LNKS區(qū)域擴(kuò)增出了745bp的核酸片段，其序列與土曲霉合成酶的這一區(qū)域序列相同
2、。結(jié)論土曲霉和紅曲霉洛伐他汀合成酶基因存在同源區(qū)域。關(guān)鍵詞:紅曲霉平；土曲霉；洛伐他汀合成酶合成酶；PCRAbstract:ObjectiveAnalysesthestructureofMonascusruber5031lovastatinbiosynthesisgenecluster.MethodsThreepairsofdegeneratePCRprimersatchingtheregionsoflovastatinbiosynthesisgeneclusterinAspergillusterreus,oneofthe
3、mis,5’primer:TTCGATGCGGCCTTCTTCAAT,3’primer:ATGGTTCGGCATCGTAATTCC.ResultsA745bpDNAsequenceplifiedbyPCRfromMonascusruber5031genomicDNAandthesequenceisthesameilarsequenceonacolinK）即洛伐他汀(lovastatin)，是膽固醇生物合成中的關(guān)鍵酶HMGCoA還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，是目前治療高血脂癥最有效的藥物之一，并且對(duì)心絞痛患者和心肌梗死患者也有一定的
4、治療效果［1］。此外，它還可下調(diào)炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),從而有益于治療動(dòng)脈粥樣硬化癥［2］。近期研究表明,它可促進(jìn)惡性甲狀腺細(xì)胞凋亡［3］.freelL，煮成稀粥，冷卻到60~65℃。將150g麥芽粉摻入大米粥中攪拌均勻，放入55~60℃保溫箱內(nèi)糖化4h，取出過濾。取250mL加250mL水，加2%的瓊脂，裝瓶、滅菌。菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基：以上培養(yǎng)基不加瓊脂。1.1.2儀器與試劑日立高速冷凍離心機(jī)。MonacolinK標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自Sigma公司。PCR引物由上海生工合成。Taq酶采用上海生工的TaqPlus。上海生工的膠回收試劑
5、盒UNIQ-10。TaKaRa公司的pMD-18T克隆載體。1.2方法1.2.1培養(yǎng)方法用2mL無菌水沖洗孢子，接入固體斜面培養(yǎng)。固體斜面培養(yǎng)7d后，以5mL水洗下，稀釋至濃度為107個(gè)/mL，取2mL加入100mL菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速150r/min。培養(yǎng)4d。1.2.2紅曲基因組DNA的提取根據(jù)文獻(xiàn)［9］的方法改進(jìn)而成。取1g菌絲，液氮中磨成粉狀，加入5mL2×CTAB緩沖液［100mmol/LtrisCl(pH8.0),20mmol/LEDTA,1.4mol/LNaCl,2%(ρ)CTAB,2%(ρ)
6、β巰基乙醇］，58℃1h，冷至室溫后加入等體積氯仿異戊醇（24∶1）抽提，10000g離心10min，取上清，加入0.1倍體積10%CTAB0.7mol/LNaCl溶液，溫和搖動(dòng)，再加入等體積氯仿異戊醇（24∶1）抽提，10000g離心10min，取上清，加入2/3體積預(yù)冷異丙醇沉淀DNA，1000g離心15min，沉淀溶于100μLTE中，加入RnaseA至終質(zhì)量濃度100μg/mL，37℃作用2h，加入等體積酚氯仿（1∶1）抽提，10000g離心10min，上清中加入2倍體積無水乙醇沉淀DNA，沉淀用70%乙醇洗1遍，
7、風(fēng)干，溶于TE，4℃保存。1.2.3PCR引物的設(shè)計(jì)3對(duì)PCR引物的設(shè)計(jì)詳見表1。表1PCR引物的設(shè)計(jì)（略）第1組引物是參照Thomas等［10］針對(duì)土曲霉的lovB基因的KS功能域序列設(shè)計(jì)的引物設(shè)計(jì)的。1.2.4PCR反應(yīng)①反應(yīng)體系：200μmol/LdNTPs,1UTaq酶，2.625mmol/LMgCl2,2μmol/LMgSO4,10mmol/LKCl,.freelmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LTrisHCl(pH8.75),0.1%Tritonx100,0.1mg/mLBSA,模板40ng（基因組
8、DNA和cDNA）,引物60ng，總反應(yīng)體積20μL。②熱循環(huán)條件：94℃預(yù)變性5min，之后以94℃1min，50℃1min，72℃2min程序45個(gè)循環(huán)，延伸72℃10min。1.2.5lovB擴(kuò)增片段的克隆與測(cè)序回收及克隆紅曲的lovB引物擴(kuò)增產(chǎn)物中約750bp的片段，其中連接反應(yīng)液成分為pMD1
