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《洛伐他汀合成酶調控基因love和mkh的克隆及其序列分析比較論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、洛伐他汀合成酶調控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比較論文黃欣朱碧云呂帶弟陳偉立黃曉琳李浩明【摘要】目的克隆紅曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶調控基因lovE和mkH，并進行序列分析和同源性比較。方法根據(jù)GeneBank土曲霉和紅曲霉洛伐他汀合成酶基因序列設計引物，以土曲霉和紅曲霉基因組DNA為模板PCR擴增lovE和mkH基因并克隆到pMD19Tsimple載體。利用DNAMAN等軟件以及互聯(lián)網(wǎng)資源對lovE和mkH測序結果與其編碼的氨基酸序列進行分析比對。結果分別擴增得到1512bp和1464b
2、p的目的片段lovE和mkH。結論lovE和mkH同源性很高，并與GeneBank中相關已知序列基本相同，是洛伐他汀生物合成酶調控基因，且其表達產(chǎn)物為GAL4類轉錄因子?！娟P鍵詞】土曲霉紅曲霉洛伐他汀轉錄因子調控基因洛伐他汀是膽固醇生物合成中的關鍵酶HMGCoA還原酶的競爭性抑制劑，是目前治療高血脂癥最有效的藥物之一［1-3］，它可下調炎癥相關轉錄因子的表達SubLoc/）表明lovE和mkH蛋白未顯示典型的N端信號肽區(qū)域，SubLoc分別以84%，94%的精確度和RI=3，5的可靠性指數(shù)預測兩蛋
3、白在核內(nèi)。SignalP分析（SubLoc/）表明lovE和mkH蛋白未顯示典型的N端信號肽區(qū)域，SubLoc分別以84%，94%的精確度和RI=3，5的可靠性指數(shù)預測兩蛋白在核內(nèi)。SignalP分析（.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預測結果顯示兩蛋白均非分泌蛋白，且存在信號肽的可能性分別為10.4%和0。3.3.3疏水性分析疏水和親水是氨基酸固有的特性，蛋白質結構的特征是疏水和親水間的平衡，其結構的穩(wěn)定在很大程度上有賴于分子內(nèi)的疏水作用。疏水性預測和分析對于蛋白質次級結構
4、的預測及功能分析都有較為重要的參考意義。將測序結果遞交到服務器.expasy.org/cgibin/protscale.pl采用kyte和Doolittle的方法得出兩蛋白大部分氨基酸是親水的，因此屬于親水蛋白。這也和signalP以及亞細胞定位分析預測結果一致為核內(nèi)的非分泌蛋白，蛋白通過核孔復合體進入核內(nèi)需要親水基團的參與。3.3.4蛋白高級結構及功能分析蛋白質通常含有一些結構域和特殊的保守位點，而這樣的結構涉及某種進化起源或者負責特殊的功能。將測序結果遞交到自動比較同源蛋白建模服務器SODEL
5、.html)及PredictProtein(.predictprotein.org/)對lovE和mkH編碼氨基酸序列進行高級結構分析。再通過VASTSearchStructure（.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html）分析上述獲得的pdb文件，其結果用Cn3D軟件如圖3所示：圖3蛋白高級結構分析（A為lovE蛋白，B為mkH蛋白）（略）Figure3Advancedstructureanalysis（AforlovEproteinandB
6、formkHprotein）圖3中兩蛋白均具有Zn2Cys6雙核簇合物的鋅指結構DNA結合結構域，該保守結構域發(fā)現(xiàn)于如GAL4型的轉錄因子，曾在釀酒酵母中證實GAL4為半乳糖誘導的基因表達正調控子。此結構域由2個α螺旋環(huán)繞成富集半胱氨酸的鋅指基序（參與Zn依賴性的DNA結合）并由無規(guī)則卷曲串聯(lián)起來。該類結構域還涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸鹽、麥芽糖和半乳糖的代謝，以及酰胺和α氨基丁酸的降解與亮氨酸的生物合成等。4討論洛伐他汀是目前治療高血脂癥的常用藥物之一。國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)洛伐他汀的效率并不理想，
7、以致研究者們紛紛以增產(chǎn)洛伐他汀為目標開展多方面的研究。目前從基因工程方面著手改善其產(chǎn)量成為熱點。本文克隆的lovE和mkH基因編碼產(chǎn)物是一個洛伐他汀生物合成的調控蛋白或轉錄因子，對其深入研究將有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。Kennedy、Park等將lovE基因突變失活導致檢測不到任何洛伐他汀中間產(chǎn)物，同時將一個額外拷貝的lovE轉化土曲霉，洛伐他汀產(chǎn)量增加5～7倍［10,16］。從上述數(shù)據(jù)可以看出對lovE和mkH基因以及其編碼蛋白的結構功能的進一步研究將為深入理解洛伐他汀生物合成及其遺傳調控
8、方面提供參考，且為進一步表達基因、純化相關蛋白、制備多克隆抗體、研究基因體外轉錄、轉錄因子與DNA的體外模擬結合以深入了解該類轉錄因子生物學功能和作用機理奠定了實驗基礎。本研究利用國際互聯(lián)網(wǎng)生物信息學資源，通過計算分析兩蛋白物理化學特性，得知此兩核蛋白和一些轉錄因子以及調控序列編碼產(chǎn)物有共同的GAL4類鋅指結構保守序列區(qū)。相似性搜索比對得知lovE和mkH不論基因還是編碼產(chǎn)物序列都具有高度相似性，存在共同的DNA結合保守序列?！?/p>
