檀香萜烯合成酶基因的克隆與序列分析的論文

《檀香萜烯合成酶基因的克隆與序列分析的論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、檀香萜烯合成酶基因的克隆與序列分析的論文作者：文海濤，趙紅英，林勵(lì)，邱賢秀【摘要】目的通過克隆技術(shù)獲得參與檀香揮發(fā)油形成的萜烯合成酶基因。方法利用ctablicl法提取檀香已結(jié)香心材總rna，采用rtpcr技術(shù)克隆萜烯合成酶基因。結(jié)果克隆獲得了一個(gè)檀香萜烯合成酶基因，該基因編碼區(qū)全長1731bp，編碼576個(gè)氨基酸殘基。結(jié)論ctablicl法能提取較高質(zhì)量的檀香心材總rna，克隆獲得的萜烯合成酶具有編碼區(qū)?！娟P(guān)鍵詞】檀香;萜烯合成酶;基因克隆;序列分析　abstract:objectivetoclonetheterpenesynthasegen

2、efromsantalumalbuml.ethodsctablicltreatmenttheheartalbuml.andrtpcrployedtoclonetheterpenesynthasegeneatthesametime.resultsoneterpenesynthasegeneconsistedof1731bpnucleicacidsantalumalbuml.,inoacidresidues.conclusionctablicltreatmentcouldextracthighqualityrnafromtheheartalbuml

3、.,andtheclonedterpenesynthasegenehadtheopenreadingframe.　　keyalbuml.;terpenesynthase;genecloning;sequenceanalysis　　名貴中藥檀香為檀香科植物檀香(santalumalbuml.)的樹干心材，為行氣溫中、開胃止痛之常用中藥[1]。.檀香原產(chǎn)于印度、印度尼西亞等地，1962年華南植物園從印尼引種檀香并在廣東地區(qū)試種成功[2]。檀香在自然生長情況下需10年左右才能初步形成具有芳香氣味的心材(俗稱結(jié)香)，30年以上才能供藥用，檀香心材揮發(fā)油是其主

4、要活性成分，已有研究表明檀香揮發(fā)油主要成分為萜烯類化合物，其中檀香醇等倍半萜烯類占揮發(fā)油總量的60%～80%[3]。　　目前國內(nèi)外對(duì)檀香研究的報(bào)道主要集中于檀香栽培技術(shù)和檀香揮發(fā)油組分分析上[4]，而對(duì)檀香心材揮發(fā)油積累機(jī)理卻鮮見報(bào)道。鑒于此，本研究擬對(duì)參與檀香萜烯類化合物生物合成過程中的關(guān)鍵酶——萜烯合成酶基因進(jìn)行克隆和分析。萜類物質(zhì)的前體異戊烯基焦磷酸在萜烯合成酶的作用下形成不同的萜類骨架，經(jīng)過不同修飾酶的作用后形成不同的萜類化合物，該酶基因的克隆將為闡明檀香揮發(fā)油積累的機(jī)理提供理論支持，同時(shí)也為利用基因工程手段培育檀香良種、縮短檀香生長年限以及

5、提高檀香揮發(fā)油含量等方面研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?！　?材料與方法　　1.1材料和試劑　　1.1.1材料供試材料為廣東湛江南藥試驗(yàn)場(chǎng)的已結(jié)香檀香(santalumalbuml.)心材，檀香樹由廣東省中藥研究所邱金裕研究員鑒定為檀香科植物檀香santalumalbuml.。采用鉆孔取樣的方式收集已結(jié)香部分心材，裝入試管后迅速放入液氮罐速凍，取回后保存于-80℃冰箱?！　?.1.2試劑　　rna提取試劑包括溶液ⅰ與溶液ⅱ，溶液ⅰ:2%ctab,2%pvpk30,2mol·l-1nacl，100mmol·l-1trishcl(ph8.0)，25mmol·l-

6、1edta(ph8.0)，0.5g·l-1亞精胺。溶液ⅱ:0.5%sds，1mol·l-1nacl，10mmol·l-1trishcl(ph8.0)，1mmol·l-1edta(ph8.0)，2種試劑均用depc水配制。反轉(zhuǎn)錄試劑盒：采用takara公司的primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit?？寺≡噭┖校翰捎帽本┨旄萍加邢薰镜膒gmt試劑盒。taqdna聚合酶、dntp、dnamarker、t4dnaligase、限制性內(nèi)切酶等均為takara產(chǎn)品;引物合成和測(cè)序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

7、其他試劑為國產(chǎn)分析純?！　?.2方法　　1.2.1檀香心材rna提取　　參照chang等[5]方法進(jìn)行提取并稍加改良。改良之處為用三氯甲烷/異戊醇(24∶1)抽提兩次、用10mol·l-1licl沉淀過夜，其他不變?！　?.2.2反轉(zhuǎn)錄　　采用takara公司primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit反轉(zhuǎn)錄rna成cdna。步驟為：(1)在離心管中依次加入總rna4μl，oligo(dt)1μl，dntp(10mmol·l-1)1μl，加rnasefreein，迅速取出冰上放置3min;(3)按順序分別加入5×buf

8、fer4μl，rnaseinhibitor0.5μl，rnasefreeescriptrtase1μl，42