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1、檀香萜烯合成酶基因的克隆與序列分析的論文作者:文海濤,趙紅英,林勵(lì),邱賢秀【摘要】目的通過克隆技術(shù)獲得參與檀香揮發(fā)油形成的萜烯合成酶基因。方法利用ctablicl法提取檀香已結(jié)香心材總rna,采用rtpcr技術(shù)克隆萜烯合成酶基因。結(jié)果克隆獲得了一個(gè)檀香萜烯合成酶基因,該基因編碼區(qū)全長1731bp,編碼576個(gè)氨基酸殘基。結(jié)論ctablicl法能提取較高質(zhì)量的檀香心材總rna,克隆獲得的萜烯合成酶具有編碼區(qū)?!娟P(guān)鍵詞】檀香;萜烯合成酶;基因克隆;序列分析 abstract:objectivetoclonetheterpenesynthasegen
2、efromsantalumalbuml.ethodsctablicltreatmenttheheartalbuml.andrtpcrployedtoclonetheterpenesynthasegeneatthesametime.resultsoneterpenesynthasegeneconsistedof1731bpnucleicacidsantalumalbuml.,inoacidresidues.conclusionctablicltreatmentcouldextracthighqualityrnafromtheheartalbuml
3、.,andtheclonedterpenesynthasegenehadtheopenreadingframe. keyalbuml.;terpenesynthase;genecloning;sequenceanalysis 名貴中藥檀香為檀香科植物檀香(santalumalbuml.)的樹干心材,為行氣溫中、開胃止痛之常用中藥[1]。.檀香原產(chǎn)于印度、印度尼西亞等地,1962年華南植物園從印尼引種檀香并在廣東地區(qū)試種成功[2]。檀香在自然生長情況下需10年左右才能初步形成具有芳香氣味的心材(俗稱結(jié)香),30年以上才能供藥用,檀香心材揮發(fā)油是其主
4、要活性成分,已有研究表明檀香揮發(fā)油主要成分為萜烯類化合物,其中檀香醇等倍半萜烯類占揮發(fā)油總量的60%~80%[3]。 目前國內(nèi)外對(duì)檀香研究的報(bào)道主要集中于檀香栽培技術(shù)和檀香揮發(fā)油組分分析上[4],而對(duì)檀香心材揮發(fā)油積累機(jī)理卻鮮見報(bào)道。鑒于此,本研究擬對(duì)參與檀香萜烯類化合物生物合成過程中的關(guān)鍵酶——萜烯合成酶基因進(jìn)行克隆和分析。萜類物質(zhì)的前體異戊烯基焦磷酸在萜烯合成酶的作用下形成不同的萜類骨架,經(jīng)過不同修飾酶的作用后形成不同的萜類化合物,該酶基因的克隆將為闡明檀香揮發(fā)油積累的機(jī)理提供理論支持,同時(shí)也為利用基因工程手段培育檀香良種、縮短檀香生長年限以及
5、提高檀香揮發(fā)油含量等方面研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?! ?材料與方法 1.1材料和試劑 1.1.1材料供試材料為廣東湛江南藥試驗(yàn)場(chǎng)的已結(jié)香檀香(santalumalbuml.)心材,檀香樹由廣東省中藥研究所邱金裕研究員鑒定為檀香科植物檀香santalumalbuml.。采用鉆孔取樣的方式收集已結(jié)香部分心材,裝入試管后迅速放入液氮罐速凍,取回后保存于-80℃冰箱?! ?.1.2試劑 rna提取試劑包括溶液ⅰ與溶液ⅱ,溶液ⅰ:2%ctab,2%pvpk30,2mol·l-1nacl,100mmol·l-1trishcl(ph8.0),25mmol·l-
6、1edta(ph8.0),0.5g·l-1亞精胺。溶液ⅱ:0.5%sds,1mol·l-1nacl,10mmol·l-1trishcl(ph8.0),1mmol·l-1edta(ph8.0),2種試劑均用depc水配制。反轉(zhuǎn)錄試劑盒:采用takara公司的primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit??寺≡噭┖校翰捎帽本┨旄萍加邢薰镜膒gmt試劑盒。taqdna聚合酶、dntp、dnamarker、t4dnaligase、限制性內(nèi)切酶等均為takara產(chǎn)品;引物合成和測(cè)序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。
7、其他試劑為國產(chǎn)分析純?! ?.2方法 1.2.1檀香心材rna提取 參照chang等[5]方法進(jìn)行提取并稍加改良。改良之處為用三氯甲烷/異戊醇(24∶1)抽提兩次、用10mol·l-1licl沉淀過夜,其他不變?! ?.2.2反轉(zhuǎn)錄 采用takara公司primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit反轉(zhuǎn)錄rna成cdna。步驟為:(1)在離心管中依次加入總rna4μl,oligo(dt)1μl,dntp(10mmol·l-1)1μl,加rnasefreein,迅速取出冰上放置3min;(3)按順序分別加入5×buf
8、fer4μl,rnaseinhibitor0.5μl,rnasefreeescriptrtase1μl,42