何首烏苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析

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1、何首烏苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析【摘要】目的克隆何首烏苯甲酮合成酶基因并作序列分析。方法以何首烏PolygonummultiflorumThunb.為材料，根據其它植物苯甲酮合成酶(Benzalacetonesynthase，BAS)基因cDNA序列的保守區(qū)域設計引物，利用RTPCR和3`RACE，克隆其基因。結果從何首烏葉cDNA中克隆出了長度為1049bp的基因片段。序列分析表明該片段具有典型的CHS基因家族的結構域，為何首烏的BAS基因片段，命名為PmBAS。將得到的序列提交GenBank，序列號為FJ601686。對獲得的PmBAS的氨基酸序列進行比較

2、分析，發(fā)現PmBAS不含有Phe215，這種差異可能是CHS與BAS催化不同反應的重要原因之一。何首烏BAS與其它植物CHS的氨基酸序列的進化分析表明，其與同為蓼科的虎杖和掌葉大黃的同源性較近。結論對利用基因工程技術促進何首烏蒽醌合成具有重要意義。【關鍵詞】何首烏；苯甲酮合成酶；基因克隆；序列比較蒽醌（Anthraquinone）是一類重要的中草藥活性成分，常見于何首烏、決明、大黃、虎杖、蘆薈和茜草等植物中，具有抗菌、瀉下、利尿、抗氧化和過氧化作用、抗誘變和保肝等多種功效［1，2］。DepalmatumLinn.中克隆得到CHS與BAS。CHS能催化3分子的丙二酸單酰輔

3、酶A和1分子對香豆酰輔酶A結合形成查爾酮。BAS能催化1分子pcoumaroyl輔酶A與1分子的丙二酸單酰輔酶A，縮合生成具有抗炎作用的苯乙烯基丙酮。Junghanns等［7］也從掌葉大黃中克隆得到ALS，能夠催化6分子的乙酰輔酶A，形成蘆薈松。Samappito［8］等也從園葉大黃Rheumtataricum中克隆得到STS。　　何首烏PolygonummultiflorumThunb.，蓼科（Polygonaceae）傳統中藥，具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、生發(fā)、強筋骨之功效，主要含蒽醌、二苯乙烯苷類化合物和卵磷脂等活性成分［1，2］。我們以何首烏為材料，采用R

4、TPCR技術克隆其BAS基因，并進行序列分析。這對從分子水平上探討蒽醌的生物合成機制中具有重要的指導意義，并為下一步利用轉基因技術來提高何首烏蒽醌產量的研究奠定基礎?！　?材料與試劑植物材料何首烏PolygonummultiflorumThunb.采自西南交通大學峨眉校區(qū)?！　aq酶、限制性內切酶、分子量Marker為Takara產品；DNA電泳凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司；其余試劑均為上海生工生物工程公司產品?！　?方法　　2.1總RNA的提取剪取何首烏幼嫩的葉片，加液氮研磨成粉末，RNA的提取使用Tiangen公司的RNAplant植物總RNA提取試劑，具體

5、步驟按說明書進行?！　?.2cDNA的獲得以純化的RNA為模板，以oligo(dT)18:5`GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)183`為反轉錄引物，采用AMV反轉錄酶進行反轉錄獲得cDNA?！　?.3引物設計與合成根據Genbank所報道的已知植物的BAS基因的cDNA序列，使用PrimerPremier5.0引物設計軟件，由上海英俊生物技術服務有限公司合成所有引物，序列如下：中間片段引物，正向引物(P1)：5′GAATGGGGCCAACCC(T)AAGTC3′；反向引物(P2)：5′CCATAG(C)TCGTTCAAC

6、ACTTG3′。3`RACE引物，3P1：5′TGTCCAAGACTCTTCCCGTAC3′；3P2：5′TATCCTGGACCATGTTGAAGC3′?！　?.4PCRPCR擴增采用BioRAD公司的MG96G梯度PCR儀，反應條件按引物的堿基組成進行設置?！　?.5克隆與測序PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳后，利用OMEGA公司的膠回收試劑盒回收產物，連接到pMD18T載體，構建重組質粒。轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選重組子并用菌落PCR檢測，送由上海英俊生物技術服務有限公司測序?！　?.6核苷酸序列分析采用InterProScan進行結構域和功能位點預測。利用N

7、CBI(.ncbi.nih.gov)的BLAST在線分析工具分別對GenBank數據庫進行序列比對分析。采用DNAman軟件進行序列的多重比較及與進化樹繪制?！　?結果　　3.1電泳結果何首烏的BAS的中間片段PCR和3`RACE的擴增結果如圖2所示，中間片段引物進行PCR擴增后得到約660bp的片段（圖2A），3`RACE擴增出約600bp的片段（圖2B）。　　3.2PCR產物的測序分別將PCR產物進行測序。BAS基因克隆的中間片段和3`片段分別測得為659bp和595bp。根據兩個片段的測序結果，利用VectorNTISuite7