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《nogo受體拮抗劑對大鼠急性脊髓損傷的保護作用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、Nogo受體拮抗劑對大鼠急性脊髓損傷的保護作用作者：吳繼彬，楊惠林，張欽，邱志杰，丁濤【摘要】目的探討Nogo受體拮抗劑NEP1-40對大鼠脊髓損傷后脊髓功能恢復的影響，為臨床治療急性脊髓損傷提供實驗依據(jù)。方法健康ethods48healthyentalgroup(NEP1-40group).Ratmodelofmiddlethoracicspinalcordposthalftranssectionentalgroupplescollectedfromeachgroupundermunofluorescencestaining.Ratbehaviorfunctione
2、pointsasthepost-injury1and3days,1,2,3and4acontrolgroup.ThepositiveimmunofluorescenceareaofNeuN/NF-200inNEP1-40groupentofSCIisabletopromotenerveaxonregenerationofinjuredsitesandrehablitatespinalelectrophysiologicalandmotorfunctions. Keyle等［3］方法制作脊髓半橫斷模型。大鼠經(jīng)腹腔麻醉后固定于立體定位儀上，常規(guī)消毒，以第8胸椎(T8)棘
3、突為中心，手術(shù)顯露棘突。手術(shù)顯微鏡下打開T8椎板，用刀片做T10脊髓的后半橫斷，損傷深度1.0mm（橫斷后側(cè)和后外側(cè)皮質(zhì)脊髓束）。向尾側(cè)硬脊膜下置入硬脊膜管（PE-10導管，BD公司），鹽水沖洗切口，固定硬脊膜管，依次縫合，模型制作完成?！ ∩睇}水對照組通過置管每天注入生理鹽水20μl，NEP1-40組每天用微量進樣器注入NEP1-4010μl(0.4μg/μl)。每天分早、中、晚3次注射，每次注射完畢后用10μl生理鹽水沖管，以保證藥物進入蛛網(wǎng)膜下腔，連續(xù)使用4周。術(shù)后人工擠壓膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。術(shù)后3天給予青霉素4萬U／只。硬脊膜管外口予無菌保
4、護，定期換藥。 1.4標本的收集和處理 所有動物均分別于脊髓損傷1、2、3、4周時用4%多聚甲醛經(jīng)左心室-主動脈灌注后取出脊髓組織，灌注液中固定12h左右，然后放入30%蔗糖溶液中，待組織沉底，冰凍切片機切片，厚度30μm?！ ?.5檢測指標 1.5.1組織學檢查 蘇木精-伊紅染色，觀察脊髓的組織學改變?！ ?.5.2免疫熒光組織化學雙重標記染色 選取脊髓切片經(jīng)兔抗大鼠NeuN抗體(1∶500)﹑小鼠抗大鼠NF-200抗體(1∶400)4℃孵育過夜，再用抗兔IgG-FITC(1∶100)﹑抗小鼠IgG-RBITC(1∶100)37℃孵育1h，封片后用LEic
5、a激光共聚焦掃描顯微鏡觀察免疫熒光雙標結(jié)果。 1.6運動功能評定 采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)［4］運動評分法。在80cm×130cm×30cm覆蓋有防滑紙板的箱子中，每只實驗鼠由2名非實驗人獨自觀察4min，對后肢的運動功能進行評分。0～21分的分級是根據(jù)關(guān)節(jié)的運動、體重的支撐、前后肢的協(xié)調(diào)和尾的位置等情況而定。0分代表大鼠后肢無運動，21分表示大鼠后肢運動功能正常。BBB評分分別于術(shù)后第1、3、7、14、21、28天進行?！ ?.7圖像分析 免疫組化染色結(jié)果采用德國KONTRONIBAS2.5全自動圖像分析系統(tǒng)，在損傷的頭尾兩
6、側(cè)，分別取10個視野，計算免疫熒光陽性神經(jīng)細胞數(shù)。 1.8統(tǒng)計學處理 SAS9.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量數(shù)據(jù)用±s表示。2組實驗大鼠BBB評分，采用具有一個重復測量的兩因素設(shè)計的方差分析，比較不同時點指標的變化趨勢。2組免疫熒光染色陽性反應的比較采用成組設(shè)計資料t檢驗。檢驗水準（雙側(cè)）：α=0.05?！ ?結(jié)果 2.1組織改變 4周時蘇木精-伊紅染色顯示生理鹽水對照組出現(xiàn)神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，細胞體積變?。话踪|(zhì)中見較多紅細胞滲出，髓鞘腫脹和大量空泡；并有炎性細胞浸潤和膠質(zhì)細胞增生。NEP1-40實驗組灰質(zhì)腫脹變形、出血、小膠質(zhì)細胞增生和炎性細胞浸
7、潤均較損傷組輕；白質(zhì)點狀出血，白質(zhì)中有較多的正常軸突(圖1)?！ ?.2免疫組化 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到脊髓損傷1、2、3、4周后神經(jīng)元的胞體和細胞核均增大，胞質(zhì)和軸突的NF-200免疫染色為陽性，并且與NeuN共定位(圖2)。從NF-200染色陽性神經(jīng)元數(shù)目的統(tǒng)計分析可見，脊髓損傷3周后NEP1-40實驗組明顯高于生理鹽水對照組(P<0.05)(表1)。表1實驗大鼠不同時期NF-200的陽性細胞數(shù)(略) 2.3行為學觀察 術(shù)后動物均呈現(xiàn)雙后肢癱瘓，隨時間推移，2組動物的神經(jīng)功能均有不同程度的恢復。脊髓損傷后1天～2周，BBB評分兩組
