黃曲霉毒素的檢測(cè)方法研究進(jìn)展(綜述).doc

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1、黃曲霉毒素的檢測(cè)方法研究進(jìn)展(綜述)劉作新，高軍俠(1．中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽110016；2．中國科學(xué)院研究生院，北京100039)摘要：黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一類有毒致癌化合物，污染糧食及其制品，給人類健康造成嚴(yán)重威脅。本文對(duì)目前用于黃曲霉毒素的檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述。在對(duì)薄層層析法、高效液相色譜法、微柱法及酶聯(lián)免疫吸附法等檢測(cè)方法綜合分析的基礎(chǔ)上，評(píng)述了上述方法的優(yōu)劣和適用條件。關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素；檢測(cè)方法；進(jìn)展黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類有毒次生代謝物。在世界不同地區(qū)都發(fā)現(xiàn)了這些真

2、菌大量存在于供人類食用的食品中，黃曲霉毒素污染已導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全問題[1,2]。自20世紀(jì)60年代以來，有關(guān)黃曲霉毒素的危害被大量報(bào)道，以致黃曲霉毒素已成為最受人們關(guān)注的一種真菌毒素[3]。因此，尋求準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行高效的定性定量分析，是黃曲霉毒素研究的一個(gè)重要方面。1.黃曲霉毒素研究概況迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素至少包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2等l7種結(jié)構(gòu)相似且特征已知的化合物，其結(jié)構(gòu)特征為都含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?。黃曲霉毒素的理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，如B1在高溫200℃、紫外線照射下，都不能使之破壞，加熱到

3、B1的熔點(diǎn)(268～269~C)才開始分解；在酸性溶液中，B1也很穩(wěn)定，在pH1～3的強(qiáng)酸性溶液中則稍有分解【2】。黃曲霉毒素的毒性為氰化鉀的l0倍，砒霜的68倍，能引起人急性中毒死亡，與人的肝癌有密切關(guān)系，能使家畜、家禽及多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘發(fā)癌癥，其中B1、B2、G1、G2是最主要的毒素物質(zhì)，而B1是自然發(fā)生潛力最大的一種毒素【4,5】。2黃曲霉毒素的檢測(cè)方法黃曲霉毒素的檢測(cè)方法從最初以薄層層析法為主，發(fā)展到高效液相色譜法、微柱法、酶聯(lián)免疫吸附法等多種方法普遍應(yīng)用，其進(jìn)展與新的化學(xué)檢測(cè)手段和新儀器的出現(xiàn)密不可分。這些新方法、新手段的快速應(yīng)用，為黃曲霉毒素的檢測(cè)提供了更廣

4、泛的選擇余地，適應(yīng)了不同的檢測(cè)目的和要求[6].2．1薄層層析法(TLC)薄層層析法是測(cè)定黃曲霉毒素的經(jīng)典方法，其原理是將樣品經(jīng)過提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色或黃綠色熒光，并根據(jù)其在薄層上顯示的最低檢出量來確定其含量。聶孝同等【7】應(yīng)用薄層層析法采用以下步驟對(duì)飼料中的黃曲霉毒素進(jìn)行了檢測(cè)。首先是黃曲霉毒素的提?。喊逊鬯檫^20目篩的樣品放人具塞三角瓶中，加入甲醇(55：45)溶液，再加入石油醚蓋嚴(yán)，靜置片刻后，用慢速定量濾紙過濾于分液漏斗中，通人三氯甲烷，再過濾并將濾液在65℃水浴上通風(fēng)揮干，冷卻后加入苯一乙腈(98：2)充分

5、混合，然后吸取上清液待用。對(duì)雜質(zhì)少的樣品，采取直板定性。依次點(diǎn)板、展開、觀察；其中預(yù)展展開劑為無水乙醚，正展展開劑為丙酮一三氯甲烷(1：9)，且展開劑要事先加入到展開槽內(nèi)；通過觀察，無熒光出現(xiàn)為陰性．出現(xiàn)熒光則為陽性，需作直板確證，若繼續(xù)有熒光出現(xiàn)，則進(jìn)一步作定量確證；樣品的某一點(diǎn)熒光強(qiáng)度與標(biāo)樣點(diǎn)的熒光強(qiáng)度相一致，則取此點(diǎn)為樣本的黃曲霉毒素含量值，否則作稀釋定量檢測(cè)；但是對(duì)于雜質(zhì)多的樣品，須采取橫板定性；同樣經(jīng)過點(diǎn)板、展開、觀察，有熒光者為陽性檢出，進(jìn)一步作橫向確證，經(jīng)再次檢測(cè)觀察呈陽性，則需要定量確證黃曲霉毒素含量。為了提高薄層層析法的精度，建立薄層掃描法來測(cè)定黃曲

6、霉毒素，它是薄層層析法的儀器化，樣品的處理和層析條件與薄層層析法相同，只是在標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)定和結(jié)果判定上有所不同。楊焱等【8】把粉碎過篩的樣品加水濕潤后通人氯仿過濾，取濾液在65℃水浴上揮干，再用苯一乙脯溶液轉(zhuǎn)移；通過點(diǎn)板，用乙醚預(yù)展后，再用氯仿一丙酮(92：8)展開，在365nm紫外光下觀察，根據(jù)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別顯示的藍(lán)紫色、藍(lán)紫色、綠色和綠色熒光，在掃描儀上繪制AFT掃描圖譜，并由此分辨出黃曲霉毒素種類；最后作定量分析：以斑點(diǎn)面積積分值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，得到樣品的黃曲霉毒素濃度。2．2高效液相色譜法(H

7、PLC)用高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素，一般分提取、凈化、衍生和測(cè)定幾個(gè)步驟。提取通常是黃曲霉毒素分析的第一步，所用的儀器和溶劑有很多種[2,9]韓紅巖等[10]對(duì)于受黃曲霉毒素污染不同程度的玉米用60％甲醇、80％丙酮、90％乙腈提取，均得到較高的回收率，其中，80％丙酮的毒性與乙腈、甲醇相比較小，操作較為安全，是提取黃曲霉毒素的最佳選擇；王光建等[11]給樣品中加入甲醇(6：4)溶液，高速搗碎，將提取物于離心管離心5～10min后，給上清液中加入氫氧化鐵懸浮液攪勻，再加人Tris一鹽酸緩沖液，離心后待用；李佐卿等[12]首先加人氯化鈉，再加人甲醇