產(chǎn)低溫蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選及發(fā)酵條件

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1、產(chǎn)低溫蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選及發(fā)酵條件郭艾英1，凌云2，張志雯1(1河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北秦皇島，066600;2中糧華夏長(zhǎng)城葡萄酒有限公司)摘要:采用平板初篩和搖瓶復(fù)篩等方法，從渤海秦皇島海域的海水樣品中篩選到產(chǎn)低溫蛋白酶活力較高的菌株HYM-16，初步鑒定為黃色桿菌屬，設(shè)計(jì)單因素和正交試驗(yàn)，確定該菌的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，在裝液量50mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，以體積分?jǐn)?shù)0．01的接種量、搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下，25℃培養(yǎng)48h酶活最高;最適碳源、氮源分別為蔗糖、豆餅粉，2+顯著提高產(chǎn)酶量;采用MgL3(4)正交試驗(yàn)得最適發(fā)酵(4)正交

2、試驗(yàn)得最適發(fā)酵9培養(yǎng)基配方:蔗糖1g/L，豆餅粉20g/L，MgCl20．4g/L，KHPO240．5g/L，KHPO240．5g/L。經(jīng)驗(yàn)證，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基菌株酶活達(dá)－1，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了3605．8×10U·L46．9%。關(guān)鍵詞:低溫蛋白酶;篩選;發(fā)酵條件;酶活中圖分類(lèi)號(hào):Q936文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1672-7983(2011)03-0058-06蛋白酶是一類(lèi)可催化蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的酶，是重要的工業(yè)用酶之一，已被廣泛應(yīng)用于食品、洗滌、皮革、飼料等工業(yè)。目前國(guó)內(nèi)蛋白酶在常溫和低溫下酶活力不高，不能滿足市場(chǎng)需求，大規(guī)模用酶主要依賴(lài)進(jìn)口。海洋微生物自身生長(zhǎng)環(huán)境

3、(高壓、高鹽、低溫、低營(yíng)養(yǎng)、低光照等)決定其分泌的胞外酶具有［1］在低溫和高鹽存在下能夠繼續(xù)保持較高的活力，并且經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可使低溫酶活力喪失或低溫菌株選擇性失活，而不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)，這使得該酶也能夠應(yīng)用于某些條件苛刻的生產(chǎn)工藝中［2～4］。對(duì)海洋微生物低溫酶的研究與開(kāi)發(fā)，已在國(guó)內(nèi)外引起了廣泛關(guān)注。由海洋微生物生產(chǎn)低溫酶已成為發(fā)［5～7］，國(guó)內(nèi)已經(jīng)從黃海海水達(dá)國(guó)家開(kāi)發(fā)新型酶制劑的重要途徑、北極沉積物或海水中分離到多株產(chǎn)低溫［1，8～10］，其菌種蛋白酶的菌株、酶的性質(zhì)也不盡相同。作者首次從渤海海域采集的樣品分離獲得一株產(chǎn)蛋白酶活力較高的菌株HYM-16，初步鑒

4、定為黃色桿菌屬，該菌株所產(chǎn)的蛋白酶在4℃條件下處理48h，酶活保持不變，屬低溫酶，筆者對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行分析，以期為工業(yè)應(yīng)用和后續(xù)研究奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。1材料和方法1．1樣品采集2009年10月上旬于渤海秦皇島海域東經(jīng)119°60'，北緯39°93'附近，采集海水樣品共20份。1．2培養(yǎng)基1．2．1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂20g/L，作為菌體初篩和斜面菌種保藏用。1．2．2篩選培養(yǎng)基葡萄糖用于篩選蛋白酶產(chǎn)生菌。0．5g/L，KHPO240．5g/L，0．5g/L，酪蛋白10g/L，瓊脂KHPO2420g/L，1．2．3種子培養(yǎng)基葡萄糖5g/

5、L，蛋白胨10g/L。1．2．4基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖0．5g/L，KHPO240．5g/L，0．5g/L，蛋白胨KHPO2410g/L。以上培養(yǎng)基pH7．2～7．4，均用陳海水代替蒸餾水配制，121℃滅菌 30min。1．3菌株篩選1．3．1菌株初篩將采集到的樣品經(jīng)肉湯培養(yǎng)基富集培養(yǎng)24h，用滅菌陳海水進(jìn)行梯度稀釋后涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待形成單菌落，再點(diǎn)種于篩選平板進(jìn)行初篩。培養(yǎng)48h后，在菌落周?chē)渭?0g/L三氯乙酸，以鋪滿平板為度。選取水解圈較大的菌株，平板劃線純化，斜面保藏，備用。1．3．2菌株復(fù)篩將初篩菌株接種于裝液量50mL種子培養(yǎng)基

6、的250mL三角瓶中，180r/min，25℃震蕩培養(yǎng)48h，收集發(fā)酵液進(jìn)行酶活力測(cè)定。收稿日期:2010-08-11;修改稿收到日期:2011-09-123期郭艾英等產(chǎn)低溫蛋白酶海洋細(xì)菌的篩選及發(fā)酵條件591．4酶活力測(cè)定將發(fā)酵液在4500r/min，4℃離心10min，取上清液作為粗酶液，采用Folin-酚法測(cè)定蛋白酶活［11］力。以位(U)。1mL酶液在一定條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活單1．5發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化1．5．1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響挑1環(huán)菌株接入種子培養(yǎng)基，180r/min，震蕩培養(yǎng)12h，以體積分?jǐn)?shù)為0．01的菌液

7、轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，180r/min，25℃震蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng)12，24，36，48，60，72h，測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶活力。1．5．2接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響將震蕩培養(yǎng)12h的種子液，分別以體積分?jǐn)?shù)為0．005，0．010，0．015和0．020的菌液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，180r/min，25℃的條件下震蕩培養(yǎng)，48h后測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶活力。1．5．3搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響將震蕩培養(yǎng)12h的種子液，以體積分?jǐn)?shù)為0．01的菌液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，控制搖床轉(zhuǎn)速分別為120，140，160，180，200，220r/min，25℃的條件下震蕩培養(yǎng)，48h后測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶