sits在實驗性心肌細胞缺氧-復(fù)氧損傷中的作用

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1、SITS在實驗性心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用【摘要】　　目的闡明SITS所產(chǎn)生的心肌保護作用。方法建立缺氧/復(fù)氧損傷（A/R）模型及SITS預(yù)適應(yīng)模型，測定心肌細胞的搏動頻率、細胞存活率以及細胞培養(yǎng)液中LDH的變化。結(jié)果SITS預(yù)處理能明顯提高A/R損傷后細胞存活率，減少LDH的漏出，與A/R組相比均有顯著性差異（P0.01）。結(jié)論SITS預(yù)處理對心肌細胞A/R具有保護作用。此研究為尋找特異性阻斷劑，探討心肌保護藥物的新靶點提供理論與實驗依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】SITS缺氧/復(fù)氧損傷預(yù)處理心肌細胞　　自從Murry〔1〕發(fā)現(xiàn)“心肌缺血

2、預(yù)適應(yīng)保護作用”以來，研究缺血預(yù)適應(yīng)保護條件及其機理探索等成為20世紀90年代以來國際上研究心肌保護的熱點和前沿。動物實驗發(fā)現(xiàn)使用Cl-通道及Cl-轉(zhuǎn)運體系的抑制劑SITS（4-乙酰胺基4-異硫氐-2,2-二磺酸）可使多種原因誘導(dǎo)產(chǎn)生的心肌再灌注心律失常發(fā)生率顯著降低，提示SITS在心肌缺血再灌注損傷中起重要作用?！　”狙芯繑M從細胞水平闡明SITS預(yù)處理對心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷（A/R）具有保護作用，進一步尋找特異性阻斷劑，探討心肌保護藥物的新靶點。　　1材料與方法　　1.1動物Spraguer-Daa公司，其余化學試劑均為分析

3、純產(chǎn)品?！　?.3鼠心肌細胞培養(yǎng)參照Spector〔2〕等方法略加改進，取新生大鼠（1～3d），在無菌狀態(tài)下取心室肌部分剪碎，加入0.1%胰蛋白酶溶液反復(fù)消化制成細胞懸液，收集細胞于含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后置CO2培養(yǎng)箱（氣體配比為5%CO2及95%O2空氣，37℃）中培養(yǎng)?！　?.4實驗分組與操作程序?qū)⒓毎麘乙赫{(diào)成細胞濃度為5×105細胞/孔之后，按5×105細胞/孔接種于24孔培養(yǎng)板，最后置CO2培養(yǎng)箱（37℃，氣體配比為5%CO2及95%O2）中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，頭3d加入0.1mMBrdU抑制成纖

4、維細胞生長。培養(yǎng)第4天隨機分3組（n=8）進行實驗：①正常對照（Control）組換培養(yǎng)液后置培養(yǎng)箱孵育28h。②A/R組更換培養(yǎng)液后置培養(yǎng)箱孵育24h，再缺氧3h復(fù)氧2h。③SITS預(yù)適應(yīng)（SITS+A/R）組在心肌細胞培養(yǎng)液中加入各孔終濃度為2.05×10-4mmol/L的SITS預(yù)處理3h，其余處理同A/R組?！　?.5觀察指標及方法實驗各組結(jié)束后取培養(yǎng)上清液用倒置顯微鏡觀察并計數(shù)各組心肌細胞搏動的頻率。用生化分析儀測LDH活性、MTT比色法測細胞存活率?！　?.6統(tǒng)計分析定量資料以+s表示，采用系統(tǒng)統(tǒng)計軟件SPSS11.

5、5進行單因素方差分析（One-wayANOVA），P0.05為有統(tǒng)計學意義?！　?結(jié)果　　2.1各處理組對缺氧復(fù)氧心肌細胞搏動的影響　　實驗結(jié)束后在倒置顯微鏡下觀察并計錄各組心肌細胞搏動的頻率。正常對照組心肌細胞搏動相對恒定，節(jié)律規(guī)則；A/R組使心肌細胞搏動頻率減慢、搏動幅度減弱、節(jié)律不齊，有部分停搏，部分細胞搏動幅度強弱不等，與control組相比，搏動頻率有顯著性差異（P0.01）；SITS+A/R組對正常心肌細胞搏動頻率（P>0.05）、搏動幅度、節(jié)律無明顯影響，與A/R組比較有顯著性差異（P0.01）。結(jié)果見表1。

6、表1各處理組對心肌細胞搏動頻率的影響（略）　　2.2各處理組對缺氧復(fù)氧損傷后心肌細胞存活率的影響與正常對照組比，A/R組心肌細胞嚴重受損，細胞存活率較control組降低60.1%（P0.01）；SITS+A/R組明顯減輕上述A/R損害性變化，與A/R組相比細胞存活率升高55.3%（P0.01）。表明SITS預(yù)處理可明顯對抗心肌細胞A/R損傷所致的細胞存活率下降之作用。結(jié)果見表2。表2各處理組對心肌細胞存活率的影響（略）　　2.3各組對心肌細胞A/R損傷后LDH的影響與正常對照組比較，A/R組細胞懸液中LDH增加10倍（P0.0

7、1）；SITS+A/R組與A/R組比細胞懸液中的LDH活性降低（P0.01）；表明SITS預(yù)處理可對抗心肌細胞A/R損傷所致細胞培養(yǎng)液中LDH活性升高的作用。結(jié)果見表3。表3各處理組心肌細胞LDH活性（略）　　3討論　　各種原因造成組織血液灌流量減少可使細胞發(fā)生缺血性損傷，恢復(fù)血液再灌注后，缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注（I/R）損傷。早在20世紀50年代初，Harry就首先提出I/R對缺血的心肌是有害的，能加重心肌缺血損傷。　　本研究表明，SITS預(yù)處理能明顯提高A/R損傷后細胞存活率，減少LDH的漏出；與A/R組相

8、比均有顯著性差異（P0.01）。隨著對SITS心肌保護作用及機制的進一步了解，對尋找特異性阻斷劑，探討心肌保護藥物的新靶點具有重要的意義。【