均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化咪唑立賓發(fā)酵培養(yǎng)基配方

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1、均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化咪唑立賓發(fā)酵培養(yǎng)基配方關(guān)亞鵬婁忻張莉劉靚張玉蓮劉靜【摘要】本文采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法對咪唑立賓的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，考察淀粉、麩質(zhì)粉、黃豆餅粉和葡萄糖對其發(fā)酵效價(jià)和菌體生長量的影響，得到了四個(gè)因素的優(yōu)化配比(淀粉1.8%，麩質(zhì)粉1.5%，黃豆餅粉2.5%，葡萄糖0.6%)，發(fā)酵效價(jià)比對照培養(yǎng)基提高約21.3%。【關(guān)鍵詞】咪唑立賓；均勻設(shè)計(jì)法；發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)化ABSTRACTUniformdesignmethodizethefermentationmediumofmizoribine.Theeffectsof

2、starch,corngluten,soybeanmealandglucoseontitersandpackedmycelialvolumeofmizoribineummediumcontains1.8%starch,1.5%corngluten,2.5%soybeanmealand0.6%glucose.Undertheoptimumcondition,thetitersofmizoribineedium.KEYizoribine;Uniformdesign;Fermentationmedium;Optimization

3、咪唑立賓(mizoribine，MZR)是1971年由日本科學(xué)家從Eupenicillumbrefeldianum的培養(yǎng)液中分離得到的一種咪唑類核苷，其化學(xué)名為5羥基1βD呋喃糖基1H咪唑4羧酰胺，屬新型免疫抑制劑之一〔1，2〕，臨床上主要用于腎臟移植術(shù)后排異反應(yīng)的預(yù)防，治療狼瘡性腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等〔3～5〕。由于從土壤中篩選得到的其野生型產(chǎn)生菌的發(fā)酵效價(jià)比較低，不具備產(chǎn)業(yè)化的能力，所以近年來對其產(chǎn)生菌的選育和培養(yǎng)基優(yōu)化的研究工作一直在進(jìn)行。均勻設(shè)計(jì)法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于科研和生產(chǎn)

4、的各個(gè)方面〔6，7〕，它在多因素、多水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)場合比正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有更大的優(yōu)勢〔8〕。本文以均勻設(shè)計(jì)方法為基礎(chǔ)，對實(shí)驗(yàn)室保存的一株咪唑立賓產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，得到了四個(gè)主要因素的最優(yōu)配比，優(yōu)化后配方的發(fā)酵效價(jià)比對照培養(yǎng)基提高21.3%。1材料和方法1.1菌種正青霉MZ50(本實(shí)驗(yàn)室編號)，實(shí)驗(yàn)室保存。1.2培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基PDA，瓊脂，蒸餾水配制。種子培養(yǎng)基淀粉，葡萄糖，黃豆餅粉，酵母粉，氯化鈉，硫酸鎂，碳酸鈣，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(對照)淀粉，麩質(zhì)粉，黃豆餅粉，葡萄糖，pH自然。1.3搖瓶培養(yǎng)單菌落轉(zhuǎn)

5、接于斜面，待長出豐滿孢子后接種于種子培養(yǎng)基中，26℃下培養(yǎng)44～48h，然后以2.5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃搖床培養(yǎng)4d，放瓶測定效價(jià)。1.4測定方法(1)菌體生長量(packedmycelialvolume，pmv，%)取發(fā)酵液10ml，3000r/min離心15min，下層菌絲體體積占發(fā)酵液體積的百分比即菌體生長量。(2)發(fā)酵效價(jià)(u/ml)HPLC法。1.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)淀粉、麩質(zhì)粉、黃豆餅粉、葡萄糖四個(gè)因素分別為自變量X1、X2、X3和X4，相對發(fā)酵效價(jià)和菌體生長量分別為因變量Y1和Y2，各因素及水平列表1

6、。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)V4.0版軟件提供的模型，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。2結(jié)果和分析2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)上述設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果列表2。利用均勻設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用最優(yōu)回歸子集法得到相對發(fā)酵效價(jià)(Y1)對4個(gè)因素淀粉(X1)、麩質(zhì)粉(X2)、黃豆餅粉(X3)、葡萄糖(X4)的回歸方程為：Y1=722.30+866.98X4+62.40X1X3-48.82X2X3-841.34X24R2=0.9997采用自選變量法分析得到菌體生長量(Y2)對麩質(zhì)粉(X2)和葡萄糖(X4)的回歸方程為：Y2=55.91-15.99X4+13.20X2X4+2

7、6.95X2X4R2=0.9997對回歸方程的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3和表4，得到的最優(yōu)解列表5。表1U6(64)實(shí)驗(yàn)因素及其水平表2U6(64)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以上發(fā)酵效價(jià)為相對值，即設(shè)對照組的發(fā)酵效價(jià)為100，發(fā)酵效價(jià)為三次平均值。表3Y1回歸方程的方差分析表4Y2回歸方程的方差分析表5最優(yōu)解由回歸方程的方差分析表可見，Y1回歸方程的F值大于F0.05(4，1)，Y2回歸方程的F值大于F0.05(3，2)，相關(guān)系數(shù)R2值和p值都很合理，說明方程擬合很好，方程有極其顯著的意義，圖1～4為各因素對發(fā)酵效價(jià)和菌體生長量的影響

8、趨勢圖。2.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對表5得到的綜合最優(yōu)解條件進(jìn)行三批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測定發(fā)酵效價(jià)和菌體生長量，每批實(shí)驗(yàn)取3個(gè)樣品平均值，結(jié)果見表6。經(jīng)驗(yàn)證，在表6所列的最優(yōu)發(fā)酵配方條件下，發(fā)酵效價(jià)相比對照平均提高約21.3%，菌體生長量為46%，兩項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中各組配方。2.3分析由發(fā)酵效價(jià)和菌體生長量的回歸方程