用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化達(dá)托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基

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1、用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化達(dá)托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中國抗生素雜志2011年3月第36卷第3期),7'),7),4研究簡報(bào){f卜一二cc(0c_c_<由一c:,)文章編號:1OOl一8689(2011)03—00S4—04用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化達(dá)托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基Optimizingfermentationmediumofdaptomycinbyuniformdesign劉省偉趙德LiuSheng—weiandZhaoDef北大國際醫(yī)院集團(tuán)重慶大新藥業(yè)股份有限公司,重慶400700)(PKUInternationalHealthCareGroupChongqingDaxinPharmaceutica

2、lCo.,Ltd.,Chongqing400700)摘要:目的優(yōu)化達(dá)托霉索的發(fā)酵培養(yǎng)基,提高達(dá)托霉素的發(fā)酵單位.方法通過單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察不同碳源,氮源對達(dá)托霉素發(fā)酵單位的影響,篩選出適用于達(dá)托霉素發(fā)酵的碳源和氮源;再采用均勻設(shè)計(jì)對培養(yǎng)基中碳源,氮源的配比進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果和結(jié)論在備篩選的碳源中,最適用于達(dá)托霉素發(fā)酵的是糊精,最佳用量為20g/L;最優(yōu)的氮源是黃豆粉和蛋白粉合用,用量分別為30g/L~5g/L.優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基可提高達(dá)托霉素發(fā)酵單位30%以上.關(guān)鍵詞:達(dá)托霉素;發(fā)酵培養(yǎng)基;均勻設(shè)計(jì);優(yōu)化中圖分類號:R978.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(meth

3、icillin.resistantStaphylococcusaureus,MRSA)的傳播蔓延和耐萬古霉素腸球菌(vancomycin—resistantenterococci,VRE),耐萬古霉素金葡菌(vancomycin—resistantStaphy]ococcusaureus,VRSA)的不斷產(chǎn)生,臨床急迫需求新的抗生素問世.達(dá)托霉素就是應(yīng)此開發(fā)的.達(dá)托霉素是環(huán)脂肽類抗生素(結(jié)構(gòu)見圖1),其化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同于所有已有的抗生素,被公認(rèn)為萬古霉素之后的最佳備用抗生素【lJ.達(dá)托霉素對絕大多數(shù)革蘭陽性菌有抑制作用.據(jù)報(bào)道,達(dá)托霉素對2002—2005年從美國和加拿

4、大各醫(yī)院收集的10015株臨床革蘭氏陽性菌中的99%有抑制作用【2].達(dá)托霉素還具有抗MRSA,VRE,VRSA等耐藥菌的優(yōu)勢.故自2003年9月FDA首次批準(zhǔn)其注射劑用于治圖1達(dá)托霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1ThestructureofdaptomycinCH3收稿Et期:2010—06—29基金項(xiàng)目:重慶市科委科技攻關(guān)項(xiàng)目(NoCSTC2007AB5006)作者簡介:劉省偉,男,~Tq983年,學(xué)士,T=程師.Email:y~xjz0@daxinpharmcorn.'通訊作者,E-mail:zhaode@daxinpharr/1.corn用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化達(dá)托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基劉省偉

5、等療復(fù)雜皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染以來,其在臨床上應(yīng)用越來越多.本文目的即為優(yōu)選達(dá)托霉素發(fā)酵的碳源和氮源物質(zhì),并采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化達(dá)托霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基配方.1材料與方法1.1達(dá)托霉素對照品由本公司提供,中檢所標(biāo)定,批號09120.2.1.2菌種本研究室誘變選育的達(dá)托霉素生產(chǎn)菌,菌株號NR.117.1.3培養(yǎng)基配制固體培養(yǎng)基,種子液體培養(yǎng)基和基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基均按文獻(xiàn)【3J配制.1.4發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(1)碳源優(yōu)化試驗(yàn):分別用葡萄糖,蔗糖,乳糖,淀粉,甘油,糊精按等含碳量折算替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源,考察發(fā)酵效果.28℃培養(yǎng)6d,每24h取樣,HPLC檢測發(fā)酵單位.平行試驗(yàn)3份.(2

6、)氮源優(yōu)化試驗(yàn):分別用豆粕,蛋白粉,酵母粉,黃豆粉,生物氮素,花生餅粉按等含氮量折算替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源,考察發(fā)酵效果.28℃培養(yǎng)6d,每24h取樣,HPLC檢測發(fā)酵單位.平行試驗(yàn)3份.(31采用均勻設(shè)計(jì)對已篩選出的碳,氮源的配比進(jìn)行優(yōu)化.1.5達(dá)托霉素的檢測方法采用HPLC~b標(biāo)法檢測發(fā)酵液中的達(dá)托霉素單位,色譜條件見文獻(xiàn)[.樣品溶液制各:達(dá)托霉素發(fā)酵液按1:t(v/v)加入乙醇,l2000r/min離435min,上清用0.22pm濾膜過濾,棄初濾液,取續(xù)濾液20pL進(jìn)行HPLC檢測.達(dá)托霉素定量工作曲線制作.精密稱取達(dá)托霉素對照品25mg左右,用流動相溶解,定容至

7、25.0mL,得對照品母液.分別精密吸取達(dá)托霉素對照品母液0.5,1.0,2.0,4.0,6.0和8.0mL,用流動相稀釋定容至10.0mL:分別吸取各濃度對照品溶液各20.OpL進(jìn)行HPLC分析,記錄達(dá)托霉素的峰面積.以達(dá)托霉素的濃度(mg/L)為橫坐標(biāo),其峰面積)為縱坐標(biāo),作達(dá)托霉素含量測定的工作曲線.2結(jié)果2.1達(dá)托霉素含量測定工作曲線外標(biāo)法測定達(dá)托霉素含量的工作曲線見圖2.對圖2中曲線進(jìn)行線性擬合,得標(biāo)準(zhǔn)方程:15.684x+6.3219,R----0.9992表明在50.16-802.56mg