dmrt1基因cdna序列的克隆及分析

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1、Dmrtl基因cDNA序列的克隆及分析Dmrt1基因是參勾?生物發(fā)育基因家族Dmrt(Double-sexandMab-3relatedtranscriptionfactor)家族的秉要成員，是第一個(gè)在人類中克隆得到的含DM結(jié)構(gòu)域的基因。由于該基因參與脊椎動(dòng)物性腺發(fā)育而引起人們的廣泛關(guān)注(Raymondetal.，1998)，該基因的缺失可能引起雄性不育或性逆轉(zhuǎn)(Raymondetal.,1999a;Raymondetal.,1999b;Calvarietal.,2000;0ttolenghietal.,2000)。家鼠，紅耳龜，

2、密西西比鱷，紅鱒魚，秈皮蛙等物種的Dmrtl基因表達(dá)研究顯示，在生殖嵴分化時(shí)期，正在分化的精巢屮表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢中的表達(dá)董(Raymondeta1.,1999a;Raymondetal.,1999b;Kettlewelletal.,2000;Torresetal.,2002;Smithetal.,1999;Marchandetal.,2000;Shibataetal.,2002)。杏趣的是，青鏘魚Dmrtl在成熟個(gè)體的精巢、卵巢和脾屮都有表達(dá)(Ohmuro-Matsuyamaetal.，2003)。兩棲炎在進(jìn)化中是從水生到陸生的過

3、渡夾型，具冇特化的形態(tài)特征和功能，以適應(yīng)不M的生活環(huán)境(費(fèi)梁，1999)。兩棲類的染色體組型呈現(xiàn)多樣性,有的是XX/XY型，有的是ZZ/ZW型,有的是0W雌性/00雄性，還有的是XX/XY和ZZ/ZW同種共存(Schmidetai.,2001)。其性別決定和分化的機(jī)制很復(fù)雜，既不同于哺乳類和鳥類典型的基W型性別決定(GSD,geneticsexdetermination),也不同于爬行類環(huán)境型性別決定(ESD,environmentalsexdetermination)o環(huán)境因素、遺傳因素(包括性染色體和性別決定相欠基因)、還有類

4、固醇等性激素都影響兩棲動(dòng)物性別決定與分化(周林燕等，2004;黃敏毅等，2004)。黑斑蛙(Rananigromaculata)俗稱青蛙，隸屬兩柄綱(Amphbia)，無(wú)尾目(Anura)，蛙科(Kanidae)，足一廣布種(陳娥輝，1991)。黑斑蛙的雌雄個(gè)體間沒有發(fā)現(xiàn)異型染色體(陳壁輝，1991)。那么究竟該物種是怎樣進(jìn)行性別決定和分化的呢？作為性別決定候選基因，Dmrtl菽因在該物種中參與性別決定與分化嗎？如果該菽因是黑斑蛙的性別決定菽因，那么定位于該物種的哪條染色體上呢？它在黑斑蛙的性別決定分化中又扮演什么角色？為了解答這

5、些問題，首先我們要獲得黑斑蛙Dmrtl基因序列。本實(shí)驗(yàn)室季代麗等(2005)通過KT-PCK已經(jīng)獲得了黑斑蛙Dmrt1的DM結(jié)構(gòu)域序列，卯檢測(cè)不同組織的DmrtlmRNA的表達(dá)景，顯示出該基W在成體黑斑蛙的精巢組織屮柯特異表達(dá)。為了進(jìn)?-步探究黑斑蛙Dmrtl的功能，我們提取了黑斑蛙精巢組織的RXA,設(shè)計(jì)多對(duì)引物，采用H-PCR和RACE(5’-RACE和3’-RACE)技術(shù)，首次獲得了黑斑蛙Dmrtl基因的企長(zhǎng)cDNA序列，以期為探究黑斑蛙性別決定分子機(jī)制提供分子資料。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.2主要試劑RNA提取試劑盒(TrizolReag

6、ent,Invitrogen)；cDNA文庫(kù)構(gòu)逮試劑盒(SMARTTMcDNALibraryConstructionKit,Clontech)；lOObp梯度Marker購(gòu)AV-gene；DL2000Marker是Takara公司產(chǎn)品;LA-Taq酶和去除RNA中的基因組DNA試劑盒購(gòu)自Takara公司;DEPC(二乙基焦碳酸鹽)。1.3實(shí)驗(yàn)器材處理所冇玻璃器皿(包括勻漿器、fi筒、廣UI瓶等)和金屬器材(包括解剖盒、解剖剪、解剖刀、解剖針等器材)，經(jīng)肥皂水浸泡刷洗，流水沖洗，蒸餾水洗滌，再經(jīng)1%oDEPC溶液37°C浸泡過夜，高

7、溫高壓滅菌后，20CTC烘烤；Eppendorf管和槍頭等耐高溫高壓的塑料制品，經(jīng)蒸餾水洗滌后，用0.1%oDEPC溶液37°C浸泡過夜，再經(jīng)高溫高壓滅菌，?去除殘衍DEPC,70-80°C烘干；電泳槽等不能高溫火菌的槊料制品，經(jīng)肥皂水浸泡刷洗，流水沖洗，蒸餾水洗滌,再經(jīng)1%>DEPC溶液浸泡4小時(shí)以上，再用1%ODEPC處理的緩沖液TBE或TAE沖凈，烘干。1.4精巢組織總RNA的提取按照TrizolReagent的操作說(shuō)明，収黑斑蛙雄性性成熟個(gè)體，活體解剖后，迅速分離精巢組織，置于DEPC處理過的、冰預(yù)冷的勻漿器屮，用解剖剪充

8、分剪碎，加RNA提取試劑lmlTrizol,迅速勻漿至勻質(zhì)進(jìn)行卜*列步驟。(操作過程必須帶手套、U罩，以免RNase污染；提取中所用的器具和溶液都耍保證無(wú)RNase)。(1)RNA分離勻漿液轉(zhuǎn)移至DEPC處理過的EP管中，室溫靜H5分鐘；加0.2m