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1、黃鱔III型Hepcidin基因cDNA克隆及序列分析 摘要：以黃鱔為材料，提取肝臟總ＲＮＡ，經(jīng)ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增出Ｈｅｐｃｉｄｉｎ基因ｃＤＮＡ的開放閱讀框及３′端非編碼區(qū)序列，序列分析表明，黃鱔Ｈｅｐｃｉｄｉｎ含有一個２７３ｂｐ的ＯＲＦ，編碼９０個氨基酸殘基，有信號肽、前體肽和成熟肽。在前肽部分具有前肽轉(zhuǎn)化酶典型的ＲＸＲ基元。同源性比對表明，黃鱔Ｈｅｐｃｉｄｉｎ與其他魚類的同源性在４０％以上，是Ｈｅｐｃｉｄｉｎ抗菌肽家族的新成員?！ ￡P(guān)鍵詞：黃鱔；抗菌肽；Ｈｅｐｃｉｄｉｎ；ｃＤＮＡ克??；序列分析 中圖分類號：Ｑ９５９．４８２；Ｑ７８５文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114
2、06－1239-03 CloningandSequenceAnalysisofTypeIIIHepcidincDNAfromRiceFieldEel ＬＩＷｅｉ，ＬＩＣｈａｎｇ－ｐｅｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Hepcidin’sｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅａｎｄ３’ｅｎｄＵＴＲｗereａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｏｆｌｉｖｅｒｏｆｒｉｃｅｆｉｅｌｄｅｅｌｂｙＲＴ－ＰＣＲａｎｄＲＡＣＥｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｂａｓｅｄｕｐｏｎｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅFJ436807ｉｎＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅ
3、ｃｌｏｎｅｄｃＤＮＡｗａｓ５８０ｂｐｗｉｔｈａ２７３ｂｐＯＲＦｅｎｃｏｄｉｎｇ９０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｔｈｅｐｒｅｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆａｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ａｐｒｏｄｏｍａｉｎａｎｄａｍａｔｕｒｅｐｅｐｔｉｄｅ．Thepropeptidecontainedthetypical.Relementofpropeptideinvertase，maturepeptidepartcontained6conservedcysteineresiduesthatcouldform3intrachaindisulfidebond.Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｌｉｇ
4、ｎｍｅｎｔｗｉｔｈｏｔｈｅｒHｅｐｃｉｄｉｎｓ，ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｒｉｃｅｆｉｅｌｄｅｅｌHｅｐｃｉｄｉｎｓｈａｒｅｈｉｇｈｉｄｅｎｔｉｔｙof40%ｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｉｔｗａｓａｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆHｅｐｃｉｄｉｎｆａｍｉｌｙ． ?。耍澹鳎铮颍洌螅海颍椋悖澹妫椋澹欤洌澹澹?；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ；Hｅｐｃｉｄｉｎ；ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ 抗菌肽具有抗細(xì)菌、真菌、寄生蟲和抑制腫瘤等重要生物學(xué)功能［１］。魚類抗菌肽是魚體天然免疫的重
5、要組成部分，其分子量小，合成速度快，在體內(nèi)擴(kuò)散迅速［２］。因此，抗菌肽產(chǎn)品在疾病防治上將是一種應(yīng)用前景廣闊的抗菌和治療藥物，可作為抗生素添加劑的良好替代品在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮不可估量的作用。Ｈｅｐｃｉｄｉｎ是一種由肝臟合成的小分子肽，參與鐵代謝，是調(diào)節(jié)鐵代謝的重要分子，目前被認(rèn)為是調(diào)節(jié)維持鐵穩(wěn)態(tài)極其重要的負(fù)激素。同時也有研究表明它們與許多富含半胱氨酸的抗菌肽類似，具有顯著的廣譜抗菌活性［３］。其基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)在不同物種間高度保守，均富含精氨酸、賴氨酸等帶正電的氨基酸殘基和６個或８個半胱氨酸殘基，形成二硫鍵結(jié)構(gòu)，屬防御素蛋白家族［４，５］。迄今為止，已知硬骨魚牙鲆［６］，虹鱒［７
6、］，真鯛［８］，金眼石?l［９］，金頭鯛［１０］，大西洋鮭魚［１１］，鯰魚［１２］，大菱鲆［１３］，斑馬魚［１４］，許氏平?O［１５］等都發(fā)現(xiàn)有Hｅｐｃｉｄｉｎ的報道。黃鱔是我國重要的名特優(yōu)淡水產(chǎn)品之一，作為性發(fā)育和分化研究的重要材料備受關(guān)注，但對其抗病功能基因的研究缺乏報道。本研究成功克隆黃鱔Hｅｐｃｉｄｉｎ基因的ＯＲＦ和３′端ｃＤＮＡ片段，并推導(dǎo)出Hｅｐｃｉｄｉｎ蛋白的一級結(jié)構(gòu)，旨為進(jìn)一步研究Hｅｐｃｉｄｉｎ的功能及其開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 ?。辈牧吓c方法 ?。保痹囼?yàn)用魚和總ＲＮＡ的提取 健康成體黃鱔購于荊州老南門水產(chǎn)品市場。黃鱔肝臟取出后迅速凍存于液氮中，然后在－８０℃
7、超低溫冰箱中保存?？偅遥危恋奶崛〔捎茫裕颍椋铮煲徊椒ㄌ崛。椒ò凑照f明書進(jìn)行。?。拨蹋绲母闻K總ＲＮＡ進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。ｃＤＮＡ合成采用Ｍ－ＭＬＶ反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行。合成的ｃＤＮＡ凍存于－２０℃下備用?！ 。保惨镌O(shè)計(jì)和ｃＤＮＡ的擴(kuò)增 ?。悖模危梁铣衫茫停停蹋郑遥澹觯澹颍螅澹裕颍幔睿螅悖颍椋穑簦幔蟀凑瘴墨I(xiàn)［８］的方法進(jìn)行。根據(jù)其他報道魚的Hｅｐｃｉｄｉｎ的序列設(shè)計(jì)了１對特異性引物ｍａｈｅｐＮ１和ｍａｈｅｐＣ１，用來擴(kuò)增黃鱔肝臟ｃＤＮＡ。ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９５℃預(yù)變性５ｍｉｎ；９４℃
