黃鱔III型Hepcidin基因cDNA克隆及序列分析.doc

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1、黃鱔III型Hepcidin基因cDNA克隆及序列分析　　摘要：以黃鱔為材料，提取肝臟總ＲＮＡ，經(jīng)ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增出Ｈｅｐｃｉｄｉｎ基因ｃＤＮＡ的開放閱讀框及３′端非編碼區(qū)序列，序列分析表明，黃鱔Ｈｅｐｃｉｄｉｎ含有一個２７３ｂｐ的ＯＲＦ，編碼９０個氨基酸殘基，有信號肽、前體肽和成熟肽。在前肽部分具有前肽轉(zhuǎn)化酶典型的ＲＸＲ基元。同源性比對表明，黃鱔Ｈｅｐｃｉｄｉｎ與其他魚類的同源性在４０％以上，是Ｈｅｐｃｉｄｉｎ抗菌肽家族的新成員。　　關(guān)鍵詞：黃鱔；抗菌肽；Ｈｅｐｃｉｄｉｎ；ｃＤＮＡ克??；序列分析　　中圖分類號：Ｑ９５９．４８２；Ｑ７８５文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114

2、06－1239-03　　　　CloningandSequenceAnalysisofTypeIIIHepcidincDNAfromRiceFieldEel　　ＬＩＷｅｉ，ＬＩＣｈａｎｇ－ｐｅｎｇ　　　?。粒猓螅簦颍幔悖簦篐epcidin’sｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅａｎｄ３’ｅｎｄＵＴＲｗereａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｏｆｌｉｖｅｒｏｆｒｉｃｅｆｉｅｌｄｅｅｌｂｙＲＴ－ＰＣＲａｎｄＲＡＣＥｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｂａｓｅｄｕｐｏｎｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅFJ436807ｉｎＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅ

3、ｃｌｏｎｅｄｃＤＮＡｗａｓ５８０ｂｐｗｉｔｈａ２７３ｂｐＯＲＦｅｎｃｏｄｉｎｇ９０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｔｈｅｐｒｅｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆａｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ａｐｒｏｄｏｍａｉｎａｎｄａｍａｔｕｒｅｐｅｐｔｉｄｅ．Thepropeptidecontainedthetypical.Relementofpropeptideinvertase，maturepeptidepartcontained6conservedcysteineresiduesthatcouldform3intrachaindisulfidebond.Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｌｉｇ

4、ｎｍｅｎｔｗｉｔｈｏｔｈｅｒHｅｐｃｉｄｉｎｓ，ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｒｉｃｅｆｉｅｌｄｅｅｌHｅｐｃｉｄｉｎｓｈａｒｅｈｉｇｈｉｄｅｎｔｉｔｙof40%ｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｉｔｗａｓａｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆHｅｐｃｉｄｉｎｆａｍｉｌｙ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｉｃｅｆｉｅｌｄｅｅｌ；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ；Hｅｐｃｉｄｉｎ；ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ　　　　抗菌肽具有抗細(xì)菌、真菌、寄生蟲和抑制腫瘤等重要生物學(xué)功能［１］。魚類抗菌肽是魚體天然免疫的重

5、要組成部分，其分子量小，合成速度快，在體內(nèi)擴(kuò)散迅速［２］。因此，抗菌肽產(chǎn)品在疾病防治上將是一種應(yīng)用前景廣闊的抗菌和治療藥物，可作為抗生素添加劑的良好替代品在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮不可估量的作用。Ｈｅｐｃｉｄｉｎ是一種由肝臟合成的小分子肽，參與鐵代謝，是調(diào)節(jié)鐵代謝的重要分子，目前被認(rèn)為是調(diào)節(jié)維持鐵穩(wěn)態(tài)極其重要的負(fù)激素。同時也有研究表明它們與許多富含半胱氨酸的抗菌肽類似，具有顯著的廣譜抗菌活性［３］。其基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)在不同物種間高度保守，均富含精氨酸、賴氨酸等帶正電的氨基酸殘基和６個或８個半胱氨酸殘基，形成二硫鍵結(jié)構(gòu)，屬防御素蛋白家族［４，５］。迄今為止，已知硬骨魚牙鲆［６］，虹鱒［７

6、］，真鯛［８］，金眼石?l［９］，金頭鯛［１０］，大西洋鮭魚［１１］，鯰魚［１２］，大菱鲆［１３］，斑馬魚［１４］，許氏平?O［１５］等都發(fā)現(xiàn)有Hｅｐｃｉｄｉｎ的報道。黃鱔是我國重要的名特優(yōu)淡水產(chǎn)品之一，作為性發(fā)育和分化研究的重要材料備受關(guān)注，但對其抗病功能基因的研究缺乏報道。本研究成功克隆黃鱔Hｅｐｃｉｄｉｎ基因的ＯＲＦ和３′端ｃＤＮＡ片段，并推導(dǎo)出Hｅｐｃｉｄｉｎ蛋白的一級結(jié)構(gòu)，旨為進(jìn)一步研究Hｅｐｃｉｄｉｎ的功能及其開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。　?。辈牧吓c方法　　１．１試驗用魚和總ＲＮＡ的提取　　健康成體黃鱔購于荊州老南門水產(chǎn)品市場。黃鱔肝臟取出后迅速凍存于液氮中，然后在－８０℃

7、超低溫冰箱中保存?？偅遥危恋奶崛〔捎茫裕颍椋铮煲徊椒ㄌ崛。椒ò凑照f明書進(jìn)行。取２μｇ的肝臟總ＲＮＡ進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。ｃＤＮＡ合成采用Ｍ－ＭＬＶ反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行。合成的ｃＤＮＡ凍存于－２０℃下備用?！　。保惨镌O(shè)計和ｃＤＮＡ的擴(kuò)增　　ｃＤＮＡ合成利用Ｍ－ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓ按照文獻(xiàn)［８］的方法進(jìn)行。根據(jù)其他報道魚的Hｅｐｃｉｄｉｎ的序列設(shè)計了１對特異性引物ｍａｈｅｐＮ１和ｍａｈｅｐＣ１，用來擴(kuò)增黃鱔肝臟ｃＤＮＡ。ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９５℃預(yù)變性５ｍｉｎ；９４℃