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《醫(yī)學畢業(yè)論文葎草花粉致敏蛋白多克隆抗體的制備及其在篩選致敏蛋白組分的應(yīng)用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、蓮莖花粉致敏量良多克隆抗體的制備及其在箍選致敏蛋白組分的應(yīng)用姓名：2014年6月25日潷草花粉致敏蛋白多克隆抗體的制備及其在篩選致敏蛋白組分的應(yīng)用作者：李雅莉，孫秀珍，高燕華，劉昀，張潔，馮向莉【摘要】0的制備、鑒定兔抗薄草花粉蛋白多克隆抗體，并初步應(yīng)用于蓰草花粉致敏蛋白組分的篩選。方法用潷草花粉變應(yīng)原浸液免疫兔，獲得高效價抗?jié)Р莼ǚ鄣?抗血清，應(yīng)用瓊脂免疫雙擴散、ELISA法以及Westernblotting鑒定產(chǎn)生的抗體。同時對蓰草花粉過敏性哮喘?患者血清進行Westernblotting檢測。結(jié)果兔抗血清效
2、價經(jīng)ELISA檢測，效價1:10000,免疫雙擴散結(jié)果表明抗血清只與樺穿花粉變應(yīng)原形成特異性IgG沉綻線，Westernblotting檢測兔抗血清IgG可以特異性識別潷草花粉8種蛋白組分，分子質(zhì)量分別為100、88、76、69、65、55、49、38ku,患者血清IgG可以識別5種蛋0組分，分子質(zhì)量分別為100、76、55、49、38ku。結(jié)論制備的兔抗血清具冇較高效價和較好的特昇性，應(yīng)用該血清篩選出的蓰草花粉致敏蛋0組分與患者血清篩選的組分相似，因此可進一步應(yīng)用于初篩cDNA表達文庫?！娟P(guān)鍵詞】李雅莉，孫秀珍
3、，高燕華，劉昀，張潔，馮向莉在我岡，萚草是僅次于蒿屬的重耍的夏秋季致敏花粉，受累人IJ眾多。蒲草花粉飄散的高峰吋間較長，誘發(fā)的癥狀較蜇，患者常常要求進行特異性免疫治療(specificimmunotherapy,SIT),并希望能K:期治；□前收床上使用的律草花粉變應(yīng)原浸液質(zhì)量難以標準化，在診斷和治療方面存在很多不足之處，而基因工程生產(chǎn)的重組變應(yīng)原則能夠克服天然變應(yīng)原浸液的局限性。W內(nèi)外研究證實采用構(gòu)建cDNA文庫、分離單一過敏原蛋白及氨基酸序列分析相結(jié)合的方法，是研究過敏原基因的首選方法。選擇高效價的抗體作為篩
4、選cDNA文庫探針，是進行診斷和治療用重組變應(yīng)原疫苗的前提。□前國內(nèi)對于寄生蟲cDNA文厙的篩選多選用免疫動物血清[13],而對于引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的過敏原基因陽性克隆篩選多用患者血清[4],未見冇應(yīng)用動物多克隆抗體和人抗血清同時篩選文庫的報道。在已構(gòu)建蒱草花粉cDNA文庫基礎(chǔ).卜.，如何快速地篩選特異的致敏蛋白組分成為研究致敏原基因的關(guān)鍵。木文旨在比較兔抗蓰草花粉多克隆抗體與人抗?jié)Р莼ǚ垩逄禺愋宰R別抗原結(jié)果，篩選出徠草花粉致敏蛋白組分的快速而特好的方法，為重組籜草花粉變應(yīng)原的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1材料與方
5、法1.1材料辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG,山羊抗人IgG（北京鼎同進口分裝）,標準蛋白（Sigma公司），PVDF膜（北京鼎國進口分裝）。5415D型高速離心機（德國eppendorf公司）,852型恒溫磁力攪拌器（常州國華電器有限公司），Vex500型超聲細胞粉碎儀（SonicsMATERIALS）,全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BioRad公口jGelDoc2000）,POLARstar酶標儀（徳國BMG公司），CAP變皮原體外檢測系統(tǒng)（瑞典Pharmacia公司），微型藥直電泳儀、轉(zhuǎn)印儀（美國BioRa
6、d公司），UV3000紫外/可見分光光度計（門本島津公司）。實驗動物：健康雄性白兔2只，體重1.92.0kg，購自丙安交通大學醫(yī)學院實驗動物巾心。1.2血清收集陽性患者血清：臨床上選擇對蓰草花粉變應(yīng)原點刺試驗（SPT它的過敏性哮喘患者10例，其中男5例，女5例，取靜脈血3mL。分離血清后，用法瑪丙亞CAP變應(yīng)原內(nèi)動檢測系統(tǒng)，收集對萚草花粉變應(yīng)原特異性反應(yīng)陽性達2級或2級以上患者血清，分裝G-7O0C保存。陰性對照血清：4例無變態(tài)反應(yīng)史健康人，各種變應(yīng)原點刺試驗陰性，取靜脈血3mL,分離血清后，-70°C保存。1.
7、3蘀草花粉變應(yīng)原浸液的制備鬥然脫落法收集萚草花粉，9號分樣篩過篩，室溫1乙醚脫脂。取脫脂花粉5g加Cocas液100mL，超聲粉碎（約150W,超聲時間5s，間隔5s，工作次數(shù)30次）后4°C下攪拌提取72h,4°C下13000xg離心30min，取上清。上清液以去離子水透析24h,自然蒸發(fā)濃縮。除茼濾過后經(jīng)滅尚檢查顯示花粉飢制提取液滅菌完全，無細菌生長，可以免疫使用。并經(jīng)考馬斯亮藍結(jié)合法測定致敏蛋白，樣品終質(zhì)量濃度為5.4g/L。1.4兔抗血清制備選2只3月齡、體重1.9-2.0kg的健康雄性家兔。免疫前3d，
8、于兔耳緣靜脈采血留作陰性對照。將一定量的蒲草花粉粗制浸液同等量的弗氏完全佐劑充分乳化后進行第1次基礎(chǔ)免疫，于兔背部皮下多點注射，每兔注射2mL;2周后進行強化免疫，將一定量的蓰草花粉粗制浸液同等量的弗氏不完全佐劑充分乳化，劑量同前。以后每隔1周進行一次加強免疫，劑量、部位同前。從第3次加強免疫丌始，每次免疫后1周于兔耳緣靜脈采血測抗體效價。當效價符合要求時頸動脈采血，37
