抗體工程重點(diǎn)總結(jié)

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1、簡(jiǎn)答題1.簡(jiǎn)述鼠源性單抗的改造原則及常見(jiàn)類(lèi)型a）改造原則：降低其免疫原性、盡量保持其親合力b）常見(jiàn)類(lèi)型：人鼠嵌合抗體、CDR移植抗體、小分子抗體2.噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的主要流程及優(yōu)點(diǎn)a）噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)：借助噬菌體展示技術(shù)，將抗體V蕋因勾噬菌體外殼蛋白基因融合表達(dá)于噬尚體表浙，從而構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)，然后通過(guò)篩選獲得特異性抗體的V區(qū)基因。b）主要流程：i.擴(kuò)增全套抗體難因ii.構(gòu)建合近的重組噬菌體我達(dá)載體iii.轉(zhuǎn)化大腸桿菌并保存c）優(yōu)點(diǎn)：i.省吋省力ii.篩選容最大iii.直接得到抗體基Wiv.可制備人源抗體和其它難于制備的抗體v.原核表

2、達(dá)d）缺點(diǎn)??i.庫(kù)界受轉(zhuǎn)化效率限制：一般不超過(guò)101（＞ii.一些抗體分了會(huì)抑制宿主菌蟲(chóng)長(zhǎng)iii.具極高親和力的抗體與抗原結(jié)合后，難以洗脫，造成￡失3.簡(jiǎn)述基因工程抗體的各表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)a）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：i.優(yōu)點(diǎn)：①.具有完整的轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工及分泌機(jī)制，抗體能被準(zhǔn)確子合成、加工和分泌②.具奮完全糖基化功能和完善的重折疊機(jī)制，可表達(dá)形成良好活性的抗體分子③.可實(shí)現(xiàn)抗體的分泌表達(dá)④.既可表達(dá)完整的抗體分子，也適合表達(dá)其它形式的小分子?因工程抗體ii.缺點(diǎn)：①.構(gòu)建周期長(zhǎng)，操作繁瑣②.表達(dá)M相對(duì)低，成木較島③.大規(guī)模生產(chǎn)受限④.

3、具潛在致癌性和病毒核酸的污染可能iii.常用的宿主細(xì)胞①.淋巴細(xì)胞：主耍是小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0、NSO②.非淋巴細(xì)胞：?？频募?xì)胞柯CHO、COSb）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：i.優(yōu)點(diǎn)：①.遺傳背景清楚②.產(chǎn)量高：130—150mg/L③.生長(zhǎng)速度快④.操作簡(jiǎn)單⑤.成本低⑥.可大規(guī)模生產(chǎn)ii.不足①.不M?有糖某化功能，不適合表達(dá)完整抗體分子②.抗體產(chǎn)物多為無(wú)活性的乜涵體形式③.存在的致熱原污染可能C）酵母表達(dá)系統(tǒng)：i.優(yōu)點(diǎn)①.遺傳背景淸楚，易操作，生產(chǎn)成木低，產(chǎn)量高1.2g/L②.具備較好的加工修飾功能，可得到較高活性的抗體分子③.消除了大

4、腸桿菌中的致熱原和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中潛4:致癌性和病毐核酸的污染ii.缺點(diǎn)：①.存在過(guò)度糖某化（50/20）影響抗體活性②.具備較好的加工修飾功能，可得到較高活性的抗體分了③.消除了人腸桿茼屮的致熱原和哺乳動(dòng)物細(xì)胞屮潛在致癌性和病毒核酸的污染d）昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)：常用的體系有兩種：一種是以重組桿狀病毒為載體；另一種是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)表達(dá)體系。i.特點(diǎn)：具有必要的翻譯后修飾、加工及分泌能力可表達(dá)各種形式基因工程抗體表達(dá)量高e）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)：i.特點(diǎn)①.可產(chǎn)生完全人源抗體②.表達(dá)抗體M?高親和性③.抗體具多樣性④.可通過(guò)雜交瘤等制備功能性抗體b）

5、植物表達(dá)系統(tǒng)：i.優(yōu)勢(shì)①.生產(chǎn)成本低②.可大規(guī)模種楨已③.種子形式保存種系④.受人類(lèi)病原體污染的危險(xiǎn)性最小1.人一鼠嵌合抗體的制備a）改造依據(jù)i.抗體的免疫原性主要C區(qū)b）主要流程i.免疫動(dòng)物ii.制備雜交瘤iii.克隆鼠源單抗的可變區(qū)基因iv.克隆人抗體恒定區(qū)基因v.構(gòu)建包含鼠V區(qū)和人C區(qū)的重組表達(dá)載體Vi.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)（如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞）c）特點(diǎn)L可減少90%以上免疫原性i.其有完備的免疫功能ii.不易被清除d）不足i.仍有一定免疫原性1.CDR移植抗體的制備a）改造依據(jù)i.CDR直接形成抗協(xié)表位結(jié)合結(jié)構(gòu)b）改造分類(lèi)i.

6、移祖抗體ii.表而殘基人源化一鑲而抗體c）移植抗體i.改造原則1.選擇FR,最大可能維持抗體的天然構(gòu)象2.將FR中N*能影響抗原結(jié)合部的AA替換為親木AA3.合適保留CDR兩側(cè)貨架序列4.可將抗體N末端數(shù)個(gè)AA（L）—起移植5.須在降低免疫原性和保持親和力權(quán)衡ii.改造方法：1.置換法：以人Ig為骨架，以鼠抗體CDR置換人抗體的CDR2.定點(diǎn)突變法：用定點(diǎn)突變的方法將人V區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序歹ljiii.制備過(guò)程：1.制備雜交瘤2.克隆V區(qū)基因3.設(shè)計(jì)移植抗體V區(qū)基因序列（mCDR+hFR）4.構(gòu)建V區(qū)基因5.與人C區(qū)

7、基因相連6.構(gòu)建H和L鏈表達(dá)載體7.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)6.常用的幾種抗體表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)a）淋巴細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：主要是小鼠母髓瘤細(xì)胞SP2/0、NSOi.特點(diǎn)1.本身不產(chǎn)生和分泌任何Ig2.具備抗體表達(dá)的原生條件和環(huán)境3.可產(chǎn)生完全活性的抗體分子4.適合表達(dá)各種重組抗體5.產(chǎn)量偏低：5ug/ml6.穩(wěn)定性不高b）非淋巴細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：常有的細(xì)胞有CHO、COSi.CHO：目前最主要的基因工程抗體生產(chǎn)細(xì)胞，常用的屬CHO工程株1.特點(diǎn)：a）遺傳竹景清楚b）轉(zhuǎn)染效率高c）適川于多種載體d）可表達(dá)各種類(lèi)型的抗體c）可K期穩(wěn)定表達(dá)冇功能活性抗體0可無(wú)

8、血清培養(yǎng)和高密度發(fā)酵g）產(chǎn)量可達(dá)200Ug/mlii.COS：由SV40病毒的人T抗原轉(zhuǎn)染猴腎細(xì)胞獲得，可長(zhǎng)期傳代1.特點(diǎn)：a）轉(zhuǎn)染的抗體DNA以游離形式存在并制b）外源基因表達(dá)迅速，瞬吋表達(dá)僅需3-6dc