vibrio spqy101胞外多糖的分離純化及抗細(xì)菌生物被膜活性研究

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1、中國(guó)海洋大學(xué)博士論文IlYllllY1llll928tlllllllll928lllltlllllllltlllltlllll4719帥Vibriosp．QYIOI胞外多糖的分離純化及抗細(xì)菌生物被膜活性研究指導(dǎo)教師簽字：監(jiān)學(xué)位論文完成日期：答辯委員會(huì)成員簽字：價(jià)撇‘^鼉／∥7I叉9’／至者一躺’倒耀p、：多砌／、．‘，二‘l中國(guó)海洋大學(xué)博士論文獨(dú)創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含

2、未獲得!逵；墊逡查基絲益塞掛型莊塑的：奎攔亙窒2或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：墓M易簽字日期：砂。，年f月仿日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，并同意以下事項(xiàng)：1、學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。2、學(xué)校可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)清華大學(xué)“

3、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊(光盤版)電子雜志社”用于出版和編入CNKI《中國(guó)知識(shí)資源總庫(kù)》，授權(quán)中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名：善鷴翮簽字：j肋簽字日期：沙·f年j月西日簽字日期：如l，年，月玎日’-。＼中0中國(guó)海洋大學(xué)博士論文Vibriosp．QYl01胞外多糖的分離純化及抗細(xì)菌生物被膜活性研究摘要細(xì)菌生物被膜是由細(xì)菌及其分泌的胞外基質(zhì)所形成的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它是抗生素滲透和作用的物理屏障。一直以來，細(xì)菌胞外多糖被認(rèn)為是生物被膜形成的重要因子，不但

4、起始細(xì)菌的粘附，而且在生物被膜復(fù)雜結(jié)構(gòu)的形成中也發(fā)揮重要的作用。然而，近期研究卻發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾種細(xì)菌的胞外多糖(例如EcoliII型莢膜多糖)不但不參與生物被膜的形成，而且能抑制其自身甚至其它細(xì)菌的生物被膜形成。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中發(fā)現(xiàn)Vibriosp．QYl01發(fā)酵液粗提物具有廣譜的生物被膜抑制活性，進(jìn)一步證明此活性與多糖類物質(zhì)有關(guān)。本文旨在對(duì)QYl01所分泌的抗細(xì)菌生物被膜活性多糖進(jìn)行分離純化，分析其性質(zhì)、組成，并深入研究抗細(xì)菌生物被膜活性及作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)首先采用離子交換色譜和凝膠排阻色譜相結(jié)合對(duì)OYlOl發(fā)酵液中的多糖進(jìn)

5、行分離純化，得到具有抗細(xì)菌生物被膜活性的多糖A101。采用現(xiàn)代儀器分析手段，包括IR、HPSEC、HPLC等，對(duì)A101的結(jié)構(gòu)特征、化學(xué)組成及分子量進(jìn)行分析。結(jié)果表明A101分子量高達(dá)546kDa，其單糖組成較復(fù)雜，但是以糖醛酸為主、其次為鼠李糖和氨基葡萄糖，其他單糖含量很低。將A101與已知弧菌胞外多糖進(jìn)行比較，結(jié)果顯示A101與具有生物被膜抑制活性的Vibriovulnffi伽M06．24I型莢膜多糖相似，都是以糖醛酸為主、帶負(fù)電荷的胞外多糖。進(jìn)一步基因克隆和生物信息學(xué)分析表明菌株Vibriosp．QYl01中的確存在

6、I型莢膜多糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Wza)，根據(jù)以上結(jié)果我們推鋇]]A101可能是QYl01的I型莢膜多糖。細(xì)菌生物被膜形成能力評(píng)價(jià)體系包括靜態(tài)模型和動(dòng)態(tài)模型，為了能對(duì)生物被膜進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，首先構(gòu)建了金黃色葡萄球菌的綠色熒光蛋白表達(dá)株RN6390一GFP，熒光倒置顯微鏡及激光共聚焦結(jié)果顯示，F(xiàn)lowcell中的RN6390生物被膜在24h達(dá)到成熟，而且在以后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡的穩(wěn)定狀態(tài)。在靜態(tài)模型條件下，A101對(duì)銅綠假單胞菌FRDl和金黃色葡萄球菌RN6390生物被膜的形成都具有明顯的抑制作用，而且這種抑制作用具有濃度依賴性。當(dāng)

7、A101的濃度達(dá)到100ug／mL時(shí)，其對(duì)銅綠假單胞茵FRDl生物被膜的抑制率達(dá)中國(guó)海洋大學(xué)博士論文75％，對(duì)金黃色葡萄球菌RN6390的抑制率超過90％。進(jìn)一步研究顯示，A101的抗生物被膜活性具有普遍性，在測(cè)試菌株中，80％(12／15)的革蘭氏陰性菌和70％(7／10)的革蘭氏陽(yáng)性菌的生物被膜形成均可以被有效抑制，其中有效率超過50％的達(dá)48％(12／25)。在動(dòng)態(tài)的Flowcell模型中，A101的生物被膜抑制活性更為明顯，100ug／mL的A101對(duì)銅綠假單胞菌FRDl生物被膜抑制率達(dá)95％以上，而對(duì)金黃色葡萄球

8、菌RN6390的抑制率甚至超過99％。實(shí)驗(yàn)中還利用Flowcell模型檢測(cè)了A101對(duì)菌體成熟生物被膜的清除作用，結(jié)果顯示，100ug／mLAl01作用12h對(duì)銅綠假單胞菌FRDl成熟生物被膜的清除率即可達(dá)85％以上，然而A101對(duì)成熟的金黃色葡萄球菌RN6390生物被膜沒有清除作用。我們對(duì)A101作用