單鏈抗體融合蛋白的研究及應(yīng)用

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1、單鏈抗體融合蛋白的研宄及應(yīng)用丁忠英(湖州市婦幼保健院浙江湖州313000)【摘要】單鏈抗體具有分子量小，免疫原性低，組織穿透力強(qiáng)，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，通過重組DNA技術(shù)將單鏈抗體(singlechainantibodyfragment,scFv)基因與其他效應(yīng)蛋白基因融合在一起，經(jīng)表達(dá)后可以得到具有scFv特性和所融合的效應(yīng)蛋白活性的scFv融合蛋白。這種融合蛋白已應(yīng)用于許多領(lǐng)域的研究中，并己顯示出較高的價(jià)值。木文就scFv融合蛋白的研究和應(yīng)用做一綜述?！娟P(guān)鍵詞】單鏈抗體融合蛋白表達(dá)載體【中圖分類號(hào)】R96【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】2095-1752(2014)16-0380

2、-02融合蛋白［1］是指采用重組DNA技術(shù)在基因水平上將兩種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)，依讀碼框架首尾連接在一起，表達(dá)產(chǎn)生的一種新蛋白質(zhì)，它具有雙方蛋白的活性，這種新型的人工蛋白具有極高的應(yīng)用價(jià)值和很好的發(fā)展前景，己廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域的研究中。單鏈抗體［1］(scFv)是現(xiàn)在研宄最多的小分子抗體，它由一段彈性連接鏈(linker)把抗體重鏈可變區(qū)(Vh)與輕鏈可變區(qū)(VI)相連而成，是只有親代抗體全部抗原結(jié)合特異性的最小功能結(jié)構(gòu)單位，只有完整抗體分子的1/6,因而具有比完整抗體具有更大的優(yōu)越性。因此，采用基因融合的方法在scFv的N端或C端，以一段多肽連接鏈和效應(yīng)蛋白連

3、接，可得到具有抗體活性和其他牛.物活性或功能的scFv融合蛋白。這種利用基因工程技術(shù)得到的scFv融合蛋白，和scFv—樣能在大腸桿菌、酵母、哺乳類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物中得到有效的表達(dá)，可以大規(guī)模生產(chǎn)抗體融合蛋白，具有很大的應(yīng)用潛力。1scFv融合蛋白的研究進(jìn)展1.1活性研究倪劍鋒［2］等人將己經(jīng)突變了稀有密碼子的人IL-2(Alal25)基因，與GD2單鏈抗體基因通過over-lap-PCR法構(gòu)建成ScFv-IL-2融合基因，并在基因的C端引入histag序列。ScFv-IL-2基因經(jīng)測(cè)序正確后連接到表達(dá)載體pSE380上，然后導(dǎo)入大腸桿菌BL21中表達(dá)。表達(dá)蛋白鑒定和提

4、純后，通過EUSA試驗(yàn)結(jié)果證明該融合蛋閂保存了與相應(yīng)抗原的結(jié)合活性和IL-2的生物活性。1.2抗降解研究抗人纖維蛋A單鏈抗體-低分子質(zhì)量尿激酶(Un-UK)融合蛋白，兼有單鏈抗體對(duì)纖維蛋白的親和性和尿激酶的溶栓活性，奮望開發(fā)成為新型導(dǎo)向溶栓藥物，但基于通用連接肽(G4S)3的IIn-lingker-UK融合蛋白在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)中表達(dá)時(shí)出現(xiàn)明顯的降解。為解決此降解問題，劉志剛［3】等人利用分子生物學(xué)方法，對(duì)Iln-UK融合蛋白進(jìn)行了分子改造，并分別研究了改造后的11種IIn-lingker-UK或UK-lingker-IIn突變體在CHO細(xì)胞中分泌性表達(dá)吋的穩(wěn)

5、定性，最終篩選到了一種抗降解的突變體。1.3親和力和穩(wěn)定性研究王慧［4］等人以獲得的抗A型肉毒毒素單鏈抗體為模板，進(jìn)行融合改構(gòu)，將人IgGl的Fc片段連接到ScFv的C端，在人腸桿菌中實(shí)現(xiàn)抗體融合蛋白ScFv-Fc的表達(dá)，體外活性檢測(cè)結(jié)果表明，重組抗體融合蛋白ScFv-Fc可以特異結(jié)合A型肉毒類毒素抗原，其相對(duì)親和力近似于母本單鏈抗體，其穩(wěn)定性高于母本單鏈抗體。1.4表達(dá)載體的研究大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)快速等優(yōu)點(diǎn)一直是重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。但當(dāng)重組蛋白的表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄后加工或翻譯后修飾時(shí)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)則往往難以勝任，特別是當(dāng)需要表達(dá)的重組蛋白富

6、含二硫鍵吋。但選用胞內(nèi)還原系統(tǒng)缺陷的菌株Origami(DE3)和共表達(dá)DsbC等方法可以促進(jìn)了胞內(nèi)二硫鍵的形成及異構(gòu)化，實(shí)現(xiàn)了人源化單鏈抗體-低分子量尿激酶融合蛋白在大腸桿菌中的功能性表達(dá)［5】。1scFv融合蛋白的應(yīng)用2.1在診斷方面的應(yīng)用劉俊霞［6］等人把堿性磷酸酶編碼區(qū)插入pSTE2-8E5質(zhì)粒DNA,用scFvC66的重鏈和輕鏈可變區(qū)DNA取代scFv-8E5的重鏈和輕鏈可變區(qū)DNA,構(gòu)成表達(dá)載體pSTE2-C66-Ap在大腸桿菌中表達(dá)，用聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡法分析產(chǎn)物活性。結(jié)果獲得一個(gè)分子量為75kD的scFvC66-Ap融合蛋白，可結(jié)合來自KGla細(xì)胞

7、裂解物中的一個(gè)分子量約60kD的蛋白質(zhì)帶,蘇結(jié)合功能可通過艽堿性磷酸酶活性直接測(cè)定。從而建立了一個(gè)用大腸桿菌制備單鏈抗體-堿性磷酸酶融合蛋白的方法，它可能取代常規(guī)的堿性磷酸酶標(biāo)記方法而用于免疫檢測(cè)。2.2在治療方面的應(yīng)用王凱［7】等人設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增人抗HER2單鏈抗體e23scFv基因和輕鏈恒定區(qū)編碼序列(Ck),連接成ScFv/Ck片段，人工合成魚精蛋白截短體(tP)序列,連接于ScFv/Ck末端、構(gòu)建成ScFv/Ck/tP融合基因，將其克隆入原核表達(dá)載體pET32a后，在大腸桿菌BL21(DE3)LysS中誘導(dǎo)表