資源描述：
《抗肺癌單鏈抗體融合綠色熒光蛋白的構(gòu)建、表達及活性研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文抗肺癌單鏈抗體融合綠色熒光蛋白的構(gòu)建、表達及活性研究姓名：于紅申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物物理學(xué)指導(dǎo)教師：龔興國20040601浙江大學(xué)碩{一學(xué)位論文抗肺癌單鏈抗體融合綠色熒光蛋白的構(gòu)建、表達及活性研究摘要抗肺癌單鏈抗體(LC一1single．chainFv，LC—lScFv)是由抗肺癌雜交瘤細胞株(LC一1)分泌的單克隆抗體經(jīng)過基因改造得到的，是具有與抗原結(jié)合能力的最小抗體片段。由于分子量小，所以與傳統(tǒng)的單克隆相比具有組織穿透能力強、免疫原性低的優(yōu)點。本文首次將完整的抗肺癌單鏈抗體與綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)結(jié)合
2、進行融合表達。理論上如果蛋白表達，應(yīng)同時具有抗體活性及光激發(fā)綠色熒光雙重功能。這為腫瘤的檢測、藥物篩選、細胞因子受體的分布以及功能等方面的研究開辟了廣闊的應(yīng)用前景。本實驗從高分泌量和活力較高的抗肺癌雜交瘤單克隆細胞株抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計引物從cDNA中PCR克隆出單鏈抗體的重鏈和輕鏈基因，克隆至-IJT載體并測序。經(jīng)重疊延1d0PCR法將重鏈和輕鏈基因構(gòu)建為單鏈抗體形式。修飾后的單鏈抗體與pET一22b(+)質(zhì)粒連接，構(gòu)建成pET22·scfv，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。在溫度30。C，誘導(dǎo)5h，IPTG的濃度為0．5mmol／L時誘導(dǎo)菌體，單鏈抗體的表達量占全菌蛋
3、白的40％。表達的蛋白尚未分泌到胞間質(zhì)，而是幾乎全部以包涵體形式存在。將包涵體抽提后通過蛋白復(fù)性技術(shù)使之復(fù)性，用Ni-NTA樹脂純化出目標蛋白，SDS—PAGE電泳分析其純度達到90％以上。競爭ELISA實驗表明產(chǎn)物具有與天然抗體相近的活力。SeFv通過基因工程方法的大量制備，克服了單克隆抗體腹水制備的有限性，降低了生產(chǎn)成本低。同時設(shè)計引物，以帶有突變型綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pEGFP為模板PCR，得多Jgfp，酶切后連接于pET--22b(+)質(zhì)粒，構(gòu)建成pET22·gfp，再將ScFv基因插入到pET22一gfp中g(shù)fp的5’端，構(gòu)成grp—sefv。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，
4、誘導(dǎo)表達后，SDS—PAGE觀察到一條與預(yù)期蛋白分子量相近的表達條帶。將菌體置于熒光顯微鏡下，485nm激發(fā)顯示強烈的綠色熒光，進一步ELISA實驗也證實該融合蛋白具有了抗體活性。關(guān)鍵詞：單鏈抗體：綠色熒光蛋白：原核表達浙江大學(xué)鋇+學(xué)位論文AbstraetAmonoclonalantibodyissecretedfromLC一1，whichsinglechainFvfragment(SeFv)namedLC-1ScFvwasconstructedbasedonrecombinantphagedisplayedtechniques．ScFvisthesmallestsegment
5、beingabletointeractwithantigenBecauseofsmallmolecularweightandlackofFc，whichcomparesconventionalantigenwithstrongforceofpenetrationandimmtmogenecity．UptotimetheexpressionoffusionproteinonGFPandScFvhasnotreported．Onthetheory,thisfusionproteinshouldbewitllgreenfluorescentandantibodyactivity．th
6、eexpressionofproteinfusionshasbeenusedfortumormonitoring，high—throughputscreeningdrugsorresearchingthefunctionoftheacceptorofcertaincellfactor．ThetotalRNA'wassolatedfromhighsecretoryvolumeandactivityantibodyLC-1monocolonycells，whichwastransferredeDNA．Thevariableregionsofheavychainandlightcha
7、inwereclonedthroughPCRaccordingtoScFvgene，respectively．ScFv’genewasformedaftertheSOEligationofVHandmodifiedVL．TheScFvgeneamplifiedbyPCRisclonedintopET-22b(+)plasmidbetweentheNcoI／SalI．a(chǎn)ndintroducedintoE．coliBL21theconstructedplasmidgaveahighlevelof
