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1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文抗肺癌單鏈抗體融合綠色熒光蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及活性研究姓名：于紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物物理學(xué)指導(dǎo)教師：龔興國20040601浙江大學(xué)碩{一學(xué)位論文抗肺癌單鏈抗體融合綠色熒光蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及活性研究摘要抗肺癌單鏈抗體(LC一1single．chainFv，LC—lScFv)是由抗肺癌雜交瘤細(xì)胞株(LC一1)分泌的單克隆抗體經(jīng)過基因改造得到的，是具有與抗原結(jié)合能力的最小抗體片段。由于分子量小，所以與傳統(tǒng)的單克隆相比具有組織穿透能力強(qiáng)、免疫原性低的優(yōu)點(diǎn)。本文首次將完整的抗肺癌單鏈抗體與綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)結(jié)合
2、進(jìn)行融合表達(dá)。理論上如果蛋白表達(dá)，應(yīng)同時(shí)具有抗體活性及光激發(fā)綠色熒光雙重功能。這為腫瘤的檢測、藥物篩選、細(xì)胞因子受體的分布以及功能等方面的研究開辟了廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)從高分泌量和活力較高的抗肺癌雜交瘤單克隆細(xì)胞株抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)引物從cDNA中PCR克隆出單鏈抗體的重鏈和輕鏈基因，克隆至-IJT載體并測序。經(jīng)重疊延1d0PCR法將重鏈和輕鏈基因構(gòu)建為單鏈抗體形式。修飾后的單鏈抗體與pET一22b(+)質(zhì)粒連接，構(gòu)建成pET22·scfv，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。在溫度30。C，誘導(dǎo)5h，IPTG的濃度為0．5mmol／L時(shí)誘導(dǎo)菌體，單鏈抗體的表達(dá)量占全菌蛋
3、白的40％。表達(dá)的蛋白尚未分泌到胞間質(zhì)，而是幾乎全部以包涵體形式存在。將包涵體抽提后通過蛋白復(fù)性技術(shù)使之復(fù)性，用Ni-NTA樹脂純化出目標(biāo)蛋白，SDS—PAGE電泳分析其純度達(dá)到90％以上。競爭ELISA實(shí)驗(yàn)表明產(chǎn)物具有與天然抗體相近的活力。SeFv通過基因工程方法的大量制備，克服了單克隆抗體腹水制備的有限性，降低了生產(chǎn)成本低。同時(shí)設(shè)計(jì)引物，以帶有突變型綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pEGFP為模板PCR，得多Jgfp，酶切后連接于pET--22b(+)質(zhì)粒，構(gòu)建成pET22·gfp，再將ScFv基因插入到pET22一gfp中g(shù)fp的5’端，構(gòu)成grp—sefv。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，
4、誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS—PAGE觀察到一條與預(yù)期蛋白分子量相近的表達(dá)條帶。將菌體置于熒光顯微鏡下，485nm激發(fā)顯示強(qiáng)烈的綠色熒光，進(jìn)一步ELISA實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該融合蛋白具有了抗體活性。關(guān)鍵詞：單鏈抗體：綠色熒光蛋白：原核表達(dá)浙江大學(xué)鋇+學(xué)位論文AbstraetAmonoclonalantibodyissecretedfromLC一1，whichsinglechainFvfragment(SeFv)namedLC-1ScFvwasconstructedbasedonrecombinantphagedisplayedtechniques．ScFvisthesmallestsegment
5、beingabletointeractwithantigenBecauseofsmallmolecularweightandlackofFc，whichcomparesconventionalantigenwithstrongforceofpenetrationandimmtmogenecity．UptotimetheexpressionoffusionproteinonGFPandScFvhasnotreported．Onthetheory,thisfusionproteinshouldbewitllgreenfluorescentandantibodyactivity．th
6、eexpressionofproteinfusionshasbeenusedfortumormonitoring，high—throughputscreeningdrugsorresearchingthefunctionoftheacceptorofcertaincellfactor．ThetotalRNA'wassolatedfromhighsecretoryvolumeandactivityantibodyLC-1monocolonycells，whichwastransferredeDNA．Thevariableregionsofheavychainandlightcha
7、inwereclonedthroughPCRaccordingtoScFvgene，respectively．ScFv’genewasformedaftertheSOEligationofVHandmodifiedVL．TheScFvgeneamplifiedbyPCRisclonedintopET-22b(+)plasmidbetweentheNcoI／SalI．a(chǎn)ndintroducedintoE．coliBL21theconstructedplasmidgaveahighlevelof
