《多抗制備方案》word版

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1、兔多抗制備方案一、材料　　(一)　動物：健康成年家兔，雄性，體重2～3公斤?！　?二)　器材：剪刀、鑷子、注射器(2ml、50ml)附針頭(16號、12號、9號)、稱量瓶(10ml)、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶(200ml)、手術(shù)器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。　　(三)　試劑　　1.　滅菌生理鹽水；　　2.　抗原：合成多肽（5mg）凍干粉；純化蛋白5mg/ml；（凍干粉可以先加入1ml滅菌生理鹽水稀釋成5mg/ml，使用時在取適量；也可以按實際情況使用，節(jié)約使用）　　3.　75%酒精；　　4.　弗氏完全佐劑（FCA）sigma產(chǎn)品；5.弗氏不完全佐劑(

2、FIA)sigma產(chǎn)品；二、免疫方法抗原劑量為1mg/每只每次，具體方法如下：1．用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以75%酒精消毒皮膚；2．第一次免疫:將1mgIgG抗原用生理鹽水稀釋至0.5ml，再加入等體積的弗氏完全佐劑(即FCA0.5ml)，用2ml注射器充分混勻后于兩只后足墊(即腳掌皮下)0.5ml；3．第二次免疫：與第一次間隔10-14天，將1mgIgG抗原用生理鹽水稀釋至0.5ml，再加入等體積的弗氏不完全佐劑(即FIA0.5ml)，用2ml注射器充分混勻后于背部皮下多點注射，每點注射0.1ml；4．第三次免疫：與第二次間隔10-14天,注射部位、劑量

3、均同第二次；5．與第三次免疫間隔5-7天后，從耳靜脈采血0.5～1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價(即試血)。效價至少應(yīng)達到1∶16以上時才能放血。6．若效價未達到要求，可用不加佐劑的抗原液(鼠IgG)耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價達到要求應(yīng)立即放血。三、放血　　(一)　心臟采血法　　1.　家兔仰面，四肢縛于動物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；　　2.　剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；3.　用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后

4、，以左拇指觸摸心臟搏動最強的部位（一般在第三和第四肋骨之間）；　　4.　用50ml注射器(連接16號針頭)，傾針45°角度，對準心搏最強處刺入心臟抽血；　　5.　將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清?！　?二)　頸動脈放血法　　1.　家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；　　2.　沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突??；　　3.　分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動脈后使之游離；　　4.　于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠心及近心端。結(jié)扎遠心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾??；　

5、　5.　用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；5.松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。四、分離血清將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時，再置4℃冰箱內(nèi)3～4小時。待血液凝固血塊收縮后，用毛細滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑(0.01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉，最終濃度)，分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩？贵w的具體效價目前可以不用ELIAS做，直接用瓊脂雙向擴散實驗在免疫三次后測下效價是否達到要求即可。弗氏體即弗氏佐劑是目前動物實驗中最常

6、用的佐劑，分為不完全弗氏佐劑和完全弗氏佐劑。不完全弗氏佐劑是液體石蠟與羊毛脂混合而成，組分比為1～5：1，可根據(jù)需要而定，通常為2：1。不完全佐劑中加卡介苗(最終濃度為2～20mg/ml)或死的結(jié)核分枝桿菌，即為完全弗氏佐劑（FCA）。乳化方法：（1）研磨法：先將佐劑加熱并取適量放入無菌的玻璃研缽內(nèi)，待冷卻后再緩緩滴入等體積的抗原溶液，邊滴邊按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，繼續(xù)研磨一段時間，使之成為乳白色粘稠的油包水乳劑。本法適于制備大量的佐劑抗原，缺點是研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大。（2）注射器混合法：將等量的弗氏佐劑和抗原溶液分別吸入

7、兩個注射器內(nèi)，兩注射器之間以一細膠管相連，注意排凈空氣，然后交替推動針管，直至形成粘稠的乳劑為止。本法優(yōu)點是容易做到無菌操作，抗原損失少，適用于制備少量的抗原乳劑。但同時難以乳化完全，個別抗原，用塑料注射器根本推不動，而用玻璃注射器又有滲漏。制備好的乳化劑經(jīng)鑒定才能適用。鑒定方法是將乳化劑滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴狀浮于水面，即乳化完全，為合格的油包水劑。（3）超聲：實驗室條件好點的，比如說有超聲破碎儀的，一定要控制超聲頻率和時間，超聲容易激發(fā)一些自由基，對抗原有未知損害。乳化方法要根據(jù)抗原和需要而定。瓊脂雙擴散試驗一、原理在溶液中的可溶性多價抗原與血清