《多抗制備》PPT課件

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1、多克隆抗體的制備及抗體效價測定目的要求掌握多克隆抗體制備的基本原理。掌握多克隆抗體制備的操作步驟。掌握肥達反應(yīng)的實驗原理、操作流程和結(jié)果判斷。熟悉ELISA的實驗原理、操作流程和結(jié)果判斷。了解細菌抗原和病毒抗原免疫程序上的異同。了解免疫動物的選擇原則。原理1、克隆(clone)：是指無性繁殖細胞系，是由單一個祖先細胞分裂繁殖而形成的一簇細胞純系。在這個家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的。2、多克隆抗體（polyclonalantibody,pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不

2、同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。3、單克隆抗體（monoclonalantibodies,mAb）：由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強、效價高、少或無交叉反應(yīng)性?？贵w的制備技術(shù)經(jīng)歷了三代：第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonalantibody）；第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體(monoclonalantibody,McAb)；第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工程抗體(g

3、eneticengineeringantibody)。Ab1Ab3Ab4單克隆抗體抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗體）脾B細胞骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤細胞HAT培養(yǎng)，稀釋單克隆抗體和多克隆抗體產(chǎn)生區(qū)別示意圖雜交瘤細胞+PEG,融合Ab2多克隆抗體制備流程（一）免疫原的制備（二）免疫動物（三）免疫血清的收集（四）免疫血清的鑒定（五）免疫血清的保存操作步驟一、免疫原的制備免疫原（immunogen）指能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞的抗原最重要的性質(zhì)是免疫原性（immunogenicity）免疫原—天

4、然抗原、人工合成抗原；蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸抗原；（一）細胞性抗原制備：綿羊紅細胞（SRBC）-溶血素；細菌-抗菌抗體（動物免疫血清）（二）可溶性抗原制備：指蛋白質(zhì)、多糖和脂類等。1）細胞的破碎（物理法、化學法）反復凍融法超聲破碎法自溶法酶處里法表面活性劑處理法2）提取與純化：①超速離心分離—是一種根據(jù)分離物質(zhì)的比重特點，通過差速或梯度密度離心，將分子大小不同的抗原顆粒分開的方法，只適宜少數(shù)大分子物質(zhì)的分離。②選擇性沉淀—選擇某抗原理化特性，采用相應(yīng)沉淀劑或溶液環(huán)境。核酸去除鹽析沉淀法有機溶劑沉淀法高分子聚合物沉淀法例：50%飽和硫酸銨鹽溶液可沉淀析出

5、學清球蛋；8%～12%PEG6000可沉淀IgG。鹽析法沉淀抗原的機理③超濾法—利用孔徑大小不同的特制薄膜對不同分子大小的抗原物質(zhì)進行濾篩。④層析法—凝膠過濾離子交換親和層析⑤電泳——（略）凝膠過濾層析(分子篩)的作用機理親和層析的作用機理3）鑒定：鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質(zhì)量、純度以及免疫學活性。蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等）分子的質(zhì)量—電泳、質(zhì)譜蛋白的純度—電泳等免疫學活性—免疫雙擴散、免疫印跡抗原性質(zhì)分析結(jié)果（三）半抗原性免疫原的制備1.載體選擇常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。（1）蛋白質(zhì)類：常用的有人血清白蛋白、牛血清白

6、蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最為常用。（2）多肽類聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一類良好的載體，常用的有多聚賴氨酸。（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘導動物產(chǎn)生良好的抗體。2.連接方法半抗原與載體的連接有物理法和化學法。物理法是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載體主要有PVP和CMC等；化學法是利用某些功能基團把半抗原連接到白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不同的方法進行連接。根據(jù)半抗原擁有的化學基團不同，連接方法主要

7、有以下幾類：①帶游離氨基或羧基以及二種基團皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。②帶有羥基、酮基、醛基的半抗原：不能直接與載體連接，需要用化學方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羥胺法等方法將之轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌锖蟛拍芘c載體連接。③帶有酚基的半抗原，可用一氯醋酸鈉法或重氮化的對氨基苯甲酸法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。（四）免疫佐劑某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑(immunoadjuvant)，簡稱佐劑

8、。佐劑的種類佐劑一般包括以下幾類：①無機佐劑：如氫氧化鋁、明釩等②生物性佐劑：如