加味四逆散治療肝纖維化量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)研究

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1、從本學(xué)科出發(fā)，應(yīng)著重選對國民經(jīng)濟(jì)具有一定實(shí)用價(jià)值和理論意義的課題。課題具有先進(jìn)性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果加味四逆散治療肝纖維化量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)研究作者：鄭旭銳，孫守才，李長秦【摘要】目的：觀察加味四逆散不同劑量與療效的關(guān)系，探討該方抗肝纖維化的合適用量。方法：采用二甲基亞硝胺腹腔注射制備大鼠肝纖維化模型，加味四逆散大、中、小不同劑量灌胃給藥，免疫組織化學(xué)方法檢測分析各組大鼠肝組織Ⅳ型膠原的含量。結(jié)果：加味四逆散中劑量影響效果優(yōu)于小劑量和大劑量，3組之間的療效呈中劑量＞小劑量＞大劑量的關(guān)系，中劑量與小、大

2、劑量比較有顯著性差異(P＜)，而小劑量與大劑量比較無顯著性差異(P＞)。結(jié)論：加味四逆散對肝纖維化有肯定的治療作用，而且中劑量療效較好。【關(guān)鍵詞】四逆散/治療應(yīng)用；肝硬化/病理學(xué)；大鼠1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠66只，體重(180±20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。藥物及試劑加味四逆散由柴胡、枳殼、白芍、甘草、黃芪、丹參、桃仁等藥組成(購自陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥房，經(jīng)本院藥物鑒定教研室鑒定，均為真品)。藥物加水浸泡常規(guī)煎煮，過濾，水浴蒸發(fā)至每1課題份量和難易程度要恰當(dāng)，博士生能在二年內(nèi)作出結(jié)果，碩士生能在一年內(nèi)作出結(jié)

3、果，特別是對實(shí)驗(yàn)條件等要有恰當(dāng)?shù)墓烙?jì)。從本學(xué)科出發(fā)，應(yīng)著重選對國民經(jīng)濟(jì)具有一定實(shí)用價(jià)值和理論意義的課題。課題具有先進(jìn)性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果mL含生藥，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。秋水仙堿(云南醫(yī)藥集團(tuán)云南藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，二甲基亞硝胺(DMN，美國Sigma公司生產(chǎn))，Ⅳ型膠原抗體(mL兔抗鼠濃縮型，武漢博士德生物制品公司生產(chǎn))，免疫組化試劑盒(第四軍醫(yī)大學(xué)免疫組化室提供)。實(shí)驗(yàn)方法.1動(dòng)物模型制備大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)選取8只作為空白對照組(A組)，其余58只均用DMN(用生理鹽水稀釋至mg/

4、mL)以10mL/kg體重腹腔注射，每日1次，每周連續(xù)d，連續(xù)4周。.2分組周造模結(jié)束后，58只大鼠共死亡8只，死亡率為%，將剩余50只造模大鼠隨機(jī)分為：B組(病理模型組)10只；C組(秋水仙堿組)10只；D組(中藥大劑量組)10只；E組(中藥中劑量組)10只；F組(中藥小劑量組)10只。.3給藥A、B組：以生理鹽水mL/只灌胃；C組：以秋水仙堿mg/kg體重灌胃；D組：以加味四逆散煎劑20mL/kg體重灌胃；E組：以加味四逆散煎劑10mL/kg體重灌胃；F組：以加味四逆散煎劑mL/kg體重灌胃。以上各組用藥均1次/d，連續(xù)用藥

5、30d后結(jié)束。.4標(biāo)本采集與制備實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將大鼠斷頭處死取新鮮肝組織左葉，10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚μm。.5觀測方法課題份量和難易程度要恰當(dāng)，博士生能在二年內(nèi)作出結(jié)果，碩士生能在一年內(nèi)作出結(jié)果，特別是對實(shí)驗(yàn)條件等要有恰當(dāng)?shù)墓烙?jì)。從本學(xué)科出發(fā)，應(yīng)著重選對國民經(jīng)濟(jì)具有一定實(shí)用價(jià)值和理論意義的課題。課題具有先進(jìn)性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果將各組石蠟切片均行常規(guī)HE染色及膠原纖維染色，光鏡下觀察。病理組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)為［2］：“-”級，正常肝臟或無明顯膠原纖維增生；“±”級，膠原纖維增生，中央靜脈

6、和匯管區(qū)有少量纖維索放散延伸，但無間隔形成；“+”級，膠原纖維增生，中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)締組織變厚，由此向四周伸出纖維索，形成不完全間隔；“”級，膠原纖維大量增生，有個(gè)別菲薄的完全間隔形成(假小葉)；“”級，完全間隔較厚，假小葉大量形成。.6加味四逆散大、中、小劑量組中Ⅳ型膠原免疫組化觀察石蠟切片，免疫組化染色按試劑盒說明進(jìn)行，SP染色法，DAB法顯色。?、粜湍z原含量以半定量的分級方式，根據(jù)顯色深淺，分布范圍及密度，分別劃為4個(gè)等級［2］。0級：陰性；1級：較少，著色淺，高倍鏡下明確陽性；2級：少量，著色中等，低倍鏡下明確陽性

7、；3級：大量，條索狀或小片狀分布，著色深。實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1加味四逆散大、中、小劑量對大鼠癥狀表現(xiàn)的影響課題份量和難易程度要恰當(dāng)，博士生能在二年內(nèi)作出結(jié)果，碩士生能在一年內(nèi)作出結(jié)果，特別是對實(shí)驗(yàn)條件等要有恰當(dāng)?shù)墓烙?jì)。從本學(xué)科出發(fā)，應(yīng)著重選對國民經(jīng)濟(jì)具有一定實(shí)用價(jià)值和理論意義的課題。課題具有先進(jìn)性，便于研究生提出新見解，特別是博士生必須有創(chuàng)新性的成果實(shí)驗(yàn)期間空白組大鼠一直精神狀態(tài)佳，皮毛光滑密澤，緊貼身體，大便正常，進(jìn)食無異常。所有造模組大鼠，則出現(xiàn)不同程度的精神不振，反應(yīng)遲鈍，飲食攝水明顯減少，糞便稀薄，皮毛凌亂，缺乏光澤；治療組于治

8、療3周后，大便逐漸干燥，進(jìn)食、攝水增加，精神狀態(tài)亦隨之好轉(zhuǎn)。其中中藥中劑量組和秋水仙堿組恢復(fù)較快，中藥大劑量組和小劑量組恢復(fù)較慢。.2加味四逆散大、中、小劑量對肝纖維化組織病理學(xué)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，光鏡下觀察可見，空白對照組：HE染色見肝組織結(jié)構(gòu)清晰，膠原纖維染色