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《acapc2蛋白純化及其抗腫瘤作用機(jī)制初步的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得四川大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。本學(xué)位論文成果是本人和在四川大學(xué)讀書期間在導(dǎo)師指導(dǎo)下取得的，論文成果歸四川大學(xué)所有，特此聲明。研究生：—}恤寶2007年4月20Et導(dǎo)肌lk男2007年4月20同四川大學(xué)博士學(xué)位論文AcAPc2蛋白的純化及其抗腫
2、瘤作用機(jī)制的初步研究研究生：童煜導(dǎo)師：張思仲研究員中文摘要犬鉤蟲抗凝血肽c2似ncylostomacaninumantieoagulantpeptidec2，AcAPc2)是從吸血寄生蟲——犬鉤蟲似ncylostomacaninum)中分離出來(lái)的一種具有抑制組織因子．VIIa復(fù)合物(fvIIa／TF)的蛋白。它通過結(jié)合于fXa的催化活性中心以外的部位而進(jìn)一步特異性抑制fVIIa／TF復(fù)合物。由于ⅣIIa／TF復(fù)合物在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，因此AcAPe2可有效地抑制凝血。AeAPc2首先是由Stanssens等利用
3、分子克隆技術(shù)分離出來(lái)的，它由84個(gè)氨基酸組成。盡管已有報(bào)道表明AcAPc2已實(shí)現(xiàn)了在Ecoli和酵母中表達(dá)，然而該重組蛋白與天然的AcAPc2氨基酸序列存在一定的差異，這在一定程度上會(huì)影響目的蛋白的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白的功能。到目前為止，利用基因工程的方法表達(dá)與天然AcAPc2氨基酸序列相同的AcAPc2(rAcAPc2)無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。蛋白質(zhì)剪接(proteinsplicing)是在蛋白質(zhì)內(nèi)含肽(intein)的自我催化作用下從翻譯后的蛋白質(zhì)前體中切除蛋白質(zhì)內(nèi)含肽，同時(shí)兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯肽(extein)通過連接反應(yīng)形成
4、一個(gè)新的具有生物活性的蛋白質(zhì)。intein對(duì)于蛋白質(zhì)工程來(lái)說(shuō)是～個(gè)功能強(qiáng)大的工具。Intein與ex．tein幾乎沒有序列同源性，天然的extein常常可以替換成外源的蛋白質(zhì)而不影響intein的剪切活性。這一點(diǎn)是以intein作為融合蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)純化的理論基四川大學(xué)博士學(xué)位論文礎(chǔ)。m們PAcl一．Tw礬系統(tǒng)利用intein的自剪切實(shí)現(xiàn)了蛋白的純化。利用這一系統(tǒng)可以得到與天然蛋白序列一致的重組蛋白質(zhì)。本研究利用pTWINl表達(dá)載體，根據(jù)AcAPc2蛋白的氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，利用引物搭橋PCR的方法合成AcAPc2的全
5、長(zhǎng)eDNA序列，成功構(gòu)建了AcAPe2原核表達(dá)載體pTWINl一AcAPe2，實(shí)現(xiàn)了AcAPc2在大腸桿菌中的高效表達(dá)。利用pTWINl載體的SSPdnaBintein的自剪切和CBD與幾丁質(zhì)的緊密結(jié)合，獲得了具有抗凝活性的、與天然AcAPc2蛋白氨基酸序列一致的rAcAPc2蛋白。絲氨酸蛋白酶參與體內(nèi)各種生命活動(dòng)的調(diào)控，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命過程。研究表明某些絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，并且可以誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的凋亡。作為絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一，AeAPC2可能會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制
6、作用。本研究通過SRB染色法發(fā)現(xiàn)，rAcAPe2蛋白能劑量依賴性地抑制人肺癌細(xì)胞NCI—H460的體外增殖。在rAeAPc2濃度達(dá)到100gg／ml時(shí)，NCI-H460細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到69％。隨后的DAPI染色、TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明rAcAPc2能夠誘導(dǎo)NCI—H460細(xì)胞發(fā)生凋亡。有資料顯示uPA／uPAR在惡性腫瘤組織中的表達(dá)水平高于正常組織和良性腫瘤，其表達(dá)水平與患者的預(yù)后有關(guān)。因此，uPA／uPAR系統(tǒng)被認(rèn)為在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。2006年，Subramanianeta1．
7、報(bào)道uPA／uPAR轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡【26】。有鑒于此，我們采用RT-PCR的方法，檢測(cè)經(jīng)rAcAPe2蛋白處理的NCI-H460細(xì)胞(rAcAPc2+)的尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase·typeplasminogenactivator，uPA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase．typeplasminogenactivatorreceptor，uPAR)的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示：隨著rAeAPc2劑量的增高，NCI-H460細(xì)胞uPA和uPAR的mRNA表達(dá)2四川大學(xué)博
8、士學(xué)位論文水平隨之降低。已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)uPA蛋白合成增加主要是由基因轉(zhuǎn)錄水平引起的，轉(zhuǎn)錄因子NF-KB在uPA和uPAR基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用，它可以增加uPA和uPAR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。NF—rB參與腫瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡作用過程，這是以NF—rB的活化為前提的?；罨腘F—rB可以上調(diào)一系列抗凋亡基因轉(zhuǎn)
