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《重組人trail與突變體的原核表達(dá)和抗腫瘤生物活性的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、AmDBSABDdmODTTE．coliEDTAhrIPTGkdLBmTRAILamDicilinbovineserumalbuminbasepairdemonizedwaterdithiothreitolEscherichiacoli英文縮略詞表ethvlenediaminotetraceticacidnOUrisopropylthio一口一D—galactosidekilodaltonsLuria—Bertanimedium氨芐青霉素牛血清白蛋白堿基對(duì)去離子水二硫蘇糖醇大腸桿菌乙二胺四乙酸丙基硫代一B—D半乳糖苷千道爾頓Luri
2、a—Bertani培養(yǎng)基relatedapoptosis腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配突inducing1igandMTT3一(4，5一dimethylthiazol一2一y1)2，5diphenyltetrazobromideliumODopticaldensityPDBproteindatabase變體四甲基偶氮唑鹽光密度蛋白庫PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝膠電泳PBSphosphate—bufferedsalinoPCRp01ymerasechainreactionrpmrot
3、ateperssecondSDSsodiumdodecylsulfate磷酸鹽緩沖液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)每分轉(zhuǎn)速秒十二烷基硫酸鈉Tristris(hydroxymethylo)aminomethane三羥甲基氫基甲烷TRAILtumorrelatedapoptosisinducing1igand腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘2導(dǎo)配體中文摘要腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF—relatedapoptosis—inducing1igand，TRAIL，也稱為Apo一2L)是wiley1995年首次克隆成功的～種新的抗腫瘤細(xì)胞因子，屬于TNF家族的
4、一個(gè)成員，在人體的多種組織中如脾、肺、前列腺、胸腺和外周血淋巴細(xì)胞等正常組織均可發(fā)現(xiàn)其表達(dá)。人TRAIL蛋白編碼281個(gè)氨基酸，它的基因位于染色體3q26。TRAIL與目前發(fā)現(xiàn)的TNF家族的其它主要成員，如TNF_a，TNF—B(也稱為淋巴毒素或LT—n)，淋巴毒素一B(LT—B)，4lBBL，OX40L，CD27L，CD30L，CD40L和FasL(CD95L，也稱為Apo—lL)等配體均為II型膜蛋白，可水解形成可溶性同源三聚體，參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的許多重要生物功能。TRAIL除了在免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)方面起重要的作用外，還與TNF家
5、族中的TNF—a、TNF—B、FasL配體可導(dǎo)致易感細(xì)胞凋亡。TRAIL與這些配體的區(qū)別在于，除可特異性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡外，不損傷正常細(xì)胞。這些細(xì)胞因子的跨膜受體含有死亡結(jié)構(gòu)閩，與配體結(jié)合導(dǎo)致引起凋亡的一系列蛋白酶反應(yīng)。本研究首先對(duì)合成的TRAIL寡核苷酸全長進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和純化，獲得了有活性的TRAIL蛋白，并驗(yàn)證其抗腫瘤效應(yīng)。同時(shí)采用分子模建方法，對(duì)TRAIL結(jié)構(gòu)進(jìn)行了缺失突變，得到了兩個(gè)突變體，并對(duì)它們進(jìn)行了熱誘導(dǎo)表達(dá)，以便深入的研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為TRAIL開發(fā)成新的抗腫瘤藥物打下基礎(chǔ)。1．人TRAIL寡核苷酸全長合
6、成及在大腸桿菌中表達(dá)和純化人TRAIL寡核甘酸全長843個(gè)堿基，我們對(duì)其分段合成，然后進(jìn)行全長拼接，并改變其中的30個(gè)密碼子，以糾正氨基酸偏性，更利于在原核載體中進(jìn)行表達(dá)。核苷酸自動(dòng)測(cè)序結(jié)果，與預(yù)想的序列一致。合成的產(chǎn)物亞克隆至pGEx一2T質(zhì)粒構(gòu)成TRAIL—pGEX一2T，然后轉(zhuǎn)染受體菌DH一5d大腸桿菌。我們?cè)诘蜏?0℃，用IPTGO．4mM／L誘導(dǎo)TRAIL融合蛋白表達(dá)，得到了TRAIL融合蛋白。然后采用親和層析方法純化TRAIL蛋白。2．TRAIL的抗腫瘤生物活性用A172人膠質(zhì)細(xì)胞瘤，B104神經(jīng)母細(xì)胞瘤，SKNsH人神
7、經(jīng)母細(xì)胞瘤，辜事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士最研究擐告BGc823胃腺癌，A549肺腺癌，H69小細(xì)胞肺癌，KB鼻咽癌等細(xì)胞株為效應(yīng)靶細(xì)胞，加入重組的TRAIL蛋白，發(fā)現(xiàn)終濃度1肛g／mlTRAIL可明顯導(dǎo)致這些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。3．計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)TRAIL突變體TRA¨．可溶性分子(sTRAIL)由膜外區(qū)的95—281位殘基組成。我們采用分子模建方法，根據(jù)TRAIL分子與其受體作用的復(fù)合物模型，借助計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)，距離幾何學(xué)及復(fù)合物空間構(gòu)象對(duì)配基TRAIL與其受體作用模式進(jìn)行三維空間展示分析，從理論上對(duì)配基TRAIL進(jìn)行缺失突變，在突變過程中
8、，使突變體保持其原有結(jié)合受體的生物學(xué)功能。經(jīng)過模建，得到了兩個(gè)TRAIL突變體，氨基酸序列分別為sTRAILI：氨基酸145—154，及173—276，和sTRAILII：氨基酸130—281。然后根據(jù)突變體堿基序列，設(shè)計(jì)引物，PcR
