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《重組人trail及突變體的原核表達和抗腫瘤生物活性研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院博士后學位論文重組人TRAIL及突變體的原核表達和抗腫瘤生物活性研究姓名：關(guān)良申請學位級別：博士后專業(yè)：神經(jīng)生物學指導教師：劉少君20020301AmDBSABDdmODTTE．coliEDTAhrIPTGkdLBmTRAILamDicilinbovineserumalbuminbasepairdemonizedwaterdithiothreitolEscherichiacoli英文縮略詞表ethvlenediaminotetraceticacidnOUrisopropylthio一口一D—galactosidekilodaltonsLuria—Bertanim
2、edium氨芐青霉素牛血清白蛋白堿基對去離子水二硫蘇糖醇大腸桿菌乙二胺四乙酸丙基硫代一B—D半乳糖苷千道爾頓Luria—Bertani培養(yǎng)基relatedapoptosis腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配突inducing1igandMTT3一(4，5一dimethylthiazol一2一y1)2，5diphenyltetrazobromideliumODopticaldensityPDBproteindatabase變體四甲基偶氮唑鹽光密度蛋白庫PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝膠電泳PBSphosphate—bufferedsalinoPCR
3、p01ymerasechainreactionrpmrotateperssecondSDSsodiumdodecylsulfate磷酸鹽緩沖液聚合酶鏈式反應每分轉(zhuǎn)速秒十二烷基硫酸鈉Tristris(hydroxymethylo)aminomethane三羥甲基氫基甲烷TRAILtumorrelatedapoptosisinducing1igand腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘2導配體中文摘要腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TNF—relatedapoptosis—inducing1igand，TRAIL，也稱為Apo一2L)是wiley1995年首次克隆成功的～種新的抗腫瘤細胞因子，屬于TNF家族的
4、一個成員，在人體的多種組織中如脾、肺、前列腺、胸腺和外周血淋巴細胞等正常組織均可發(fā)現(xiàn)其表達。人TRAIL蛋白編碼281個氨基酸，它的基因位于染色體3q26。TRAIL與目前發(fā)現(xiàn)的TNF家族的其它主要成員，如TNF_a，TNF—B(也稱為淋巴毒素或LT—n)，淋巴毒素一B(LT—B)，4lBBL，OX40L，CD27L，CD30L，CD40L和FasL(CD95L，也稱為Apo—lL)等配體均為II型膜蛋白，可水解形成可溶性同源三聚體，參與調(diào)節(jié)機體內(nèi)的許多重要生物功能。TRAIL除了在免疫調(diào)節(jié)和炎性反應方面起重要的作用外，還與TNF家族中的TNF—a、TNF—B、FasL配體可導致易感細胞凋
5、亡。TRAIL與這些配體的區(qū)別在于，除可特異性導致腫瘤細胞發(fā)生凋亡外，不損傷正常細胞。這些細胞因子的跨膜受體含有死亡結(jié)構(gòu)閩，與配體結(jié)合導致引起凋亡的一系列蛋白酶反應。本研究首先對合成的TRAIL寡核苷酸全長進行了誘導表達和純化，獲得了有活性的TRAIL蛋白，并驗證其抗腫瘤效應。同時采用分子模建方法，對TRAIL結(jié)構(gòu)進行了缺失突變，得到了兩個突變體，并對它們進行了熱誘導表達，以便深入的研究結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為TRAIL開發(fā)成新的抗腫瘤藥物打下基礎(chǔ)。1．人TRAIL寡核苷酸全長合成及在大腸桿菌中表達和純化人TRAIL寡核甘酸全長843個堿基，我們對其分段合成，然后進行全長拼接，并改變其中的30
6、個密碼子，以糾正氨基酸偏性，更利于在原核載體中進行表達。核苷酸自動測序結(jié)果，與預想的序列一致。合成的產(chǎn)物亞克隆至pGEx一2T質(zhì)粒構(gòu)成TRAIL—pGEX一2T，然后轉(zhuǎn)染受體菌DH一5d大腸桿菌。我們在低溫30℃，用IPTGO．4mM／L誘導TRAIL融合蛋白表達，得到了TRAIL融合蛋白。然后采用親和層析方法純化TRAIL蛋白。2．TRAIL的抗腫瘤生物活性用A172人膠質(zhì)細胞瘤，B104神經(jīng)母細胞瘤，SKNsH人神經(jīng)母細胞瘤，辜事醫(yī)學科學院博士最研究擐告BGc823胃腺癌，A549肺腺癌，H69小細胞肺癌，KB鼻咽癌等細胞株為效應靶細胞，加入重組的TRAIL蛋白，發(fā)現(xiàn)終濃度1肛g／ml
7、TRAIL可明顯導致這些腫瘤細胞發(fā)生凋亡。3．計算機輔助設(shè)計TRAIL突變體TRA¨．可溶性分子(sTRAIL)由膜外區(qū)的95—281位殘基組成。我們采用分子模建方法，根據(jù)TRAIL分子與其受體作用的復合物模型，借助計算機圖形學技術(shù)，距離幾何學及復合物空間構(gòu)象對配基TRAIL與其受體作用模式進行三維空間展示分析，從理論上對配基TRAIL進行缺失突變，在突變過程中，使突變體保持其原有結(jié)合受體的生物學功能。經(jīng)過模建，得到了兩
