單鏈TRAIL重組表達及生物學(xué)活性研究.pdf

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1、單鏈TRAIL重組表達及生物學(xué)活性研究ExpressionandBiologicalCharacterizationsingle-chainTRAIL學(xué)科名稱：專業(yè)名稱：研究生：指導(dǎo)老師：培養(yǎng)單位：生物化學(xué)與分子生物學(xué)許驥．焦炳華教授王梁華副教授第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部二。一一年五月lIIIIIIllllllllIIl＼1909289獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。本人承

2、擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。學(xué)位論文作者簽名：日期：知∥’年廠月，．店學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)聲明本人完全了解第二軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，第二軍醫(yī)大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)第二軍醫(yī)大學(xué)可以將學(xué)位論文全’文或部分內(nèi)容編入《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》、《中國優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》等數(shù)據(jù)庫進行檢索?？梢圆捎糜坝?、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名：日期：知∥年歹月導(dǎo)兩簽名二—岫一‘／J’B瓤：知礦年廣ijI，．‘日噬寺廂目錄摘要????

3、??????????．．：???????????5英文縮略詞???????????????????????10正文前言??????????????????????????12刖舌??????????????????????????12第一部分：scTRAIL編碼序列的構(gòu)建和重組蛋白誘導(dǎo)表達與純化實驗材料????????????????????????13實驗方法????????????????????????15實驗結(jié)果????????????????????????32第二部分：scTRAIL生物學(xué)活性研究實驗材料??????????????????????

4、??4l實驗方法????????????????????????42實驗結(jié)果????????????????????????46討論??????????????????????????50綜述TRAIL在抑制腫瘤細(xì)胞生長中的研究進展??????????51參考文獻????????????????????????．57致謝?????????????????????????61碩士學(xué)位論文seTRAIL融合表達及生物學(xué)活性研究摘要1995年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)，是腫瘤壞死因子超家族成員之一【l】，屬于II型跨膜蛋白。人TRAIL由281

5、aa組成，其編碼序列有843bp。C端41～281aa為胞外區(qū)，可經(jīng)半胱氨酸蛋白酶水解為只含有C端114---281aa的可溶性TRAILll拋8l【2】；但在體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)該可溶性分子被酶從膜上切下【3】oTRAIL通過特異性的死亡受體(TRAIL．RI／DR4、TRAIL．R2／DRS)來誘導(dǎo)凋亡【3】【4】。膜結(jié)合型TRAIL和TRAILll拋8l在體外均能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。TRAIL通過一個Zn2+與3個配體亞單位中第230位的半胱氨酸螯合，形成頭尾相接的鐘形三聚體，而這種同源三聚體的形式則是TRAIL和受體相結(jié)合時，發(fā)揮活性的功能模式【51。由于

6、TRAILll¨8l擁有較廣的抗瘤譜，且對正常組織細(xì)胞幾乎無毒性，近年來作為新犁抗腫瘤藥物走入臨床應(yīng)用，并已顯示出良好的腫瘤殺傷效果。但是，由于體現(xiàn)抗腫瘤活性的TRAIL三．聚體是由三段單體僅僅通過Zn”絡(luò)合而成，因此結(jié)構(gòu)較為松散，不是很穩(wěn)定，在使用時易降解而降低抗腫瘤的效果。AnjaKrippner-Heidenreich等成功地將三聚體TNF的三個單體以柔性肽鏈(GGGS)3或(GGGS)4連接成單鏈化的TNF(sClNF)。單鏈化后的scTNF仍然保持原先的三聚體結(jié)構(gòu)，且穩(wěn)定性增強，毒性減小，抗腫瘤活性略有增強【61。本研究中，我們嘗試將人TRAILll

7、拋8I三聚體的三個單體的氨基酸片段以兩段柔性氨基酸短臂(GGGS)3，頭尾相連，使之融合成為一條多肽鏈seTRAIL，即：TRAILli拋81．(GGGS)3-TRAILll拋8l-(GGGS)3-TRAILll4．,．281，以增強抗腫瘤的效果。通過PCR和限制性內(nèi)切酶酶切、連接技術(shù)，獲得編碼單鏈化蛋白scTRAIL的基因序列，構(gòu)建了含編碼人seTRAIL基因的重組質(zhì)粒，在宿主菌E．coliBL21中得到了較高水平的表達，并用麥芽糖結(jié)合蛋白親和層析柱對表達產(chǎn)物進行了初步純化，獲得了融合了麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽的可溶性重組蛋白MBP．scTRAIL。最后，對MBP

8、．scTRAIL的生物學(xué)活性進行初步研