資源描述：
《重組人單鏈il-23的構(gòu)建、表達及生物學(xué)活性的鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號密級學(xué)校代碼UDC編號學(xué)號學(xué)位論文重組人單鏈IL-23的構(gòu)建、表達及生物學(xué)活性的鑒定Constructionandexpressionofrecombinanthumansingle-chainIL-23andidentificationofitsbiologicactivity論文類別：學(xué)術(shù)研究型作者姓名指導(dǎo)教師姓名申請學(xué)位級別碩士學(xué)位授予單位學(xué)科專業(yè)免疫學(xué)研究方向抗感染免疫論文答辯時間2012年5月學(xué)位授予日期2012年6月答辯委員會主席：論文評閱人：2012年4月目錄1．中文摘要………
2、……………………………………………………………12．英文摘要……………………………………………………………………33．論文正文前言…………………………………………………………………………5材料與方法…………………………………………………………………7結(jié)果…………………………………………………………………………21討論…………………………………………………………………………304．結(jié)論…………………………………………………………………………335．參考文獻…………………………………………………………
3、…………346．附錄附錄A英中文術(shù)語縮略語對照表………………………………………37附錄B常用試劑配制…………………………………………………38附錄C個人簡歷及發(fā)表論文……………………………………………42附錄D綜述………………………………………………………………43重組人單鏈IL-23的構(gòu)建、表達及其生物學(xué)活性的鑒定??摘要目的：(1)構(gòu)建重組人單鏈IL-23(hscIL-23)融合基因及pMD18-T-hscIL-23質(zhì)粒；(2)構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28a(+)-hscIL-23和真核表達質(zhì)粒
4、pcDNA3.1(+)-hscIL-23(3)原核表達hscIL-23重組蛋白；(4)真核表達hscIL-23重組蛋白；(5)初步鑒定真核表達的hscIL-23的生物學(xué)活性。方法：(1)設(shè)計引物應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)通過一柔性接頭（linker）(Gly4Ser)3串聯(lián)擴增自本實驗室前期構(gòu)建的pMD18-T-p40質(zhì)粒和pMD18-T-p19質(zhì)粒的IL-23p40和p19亞基基因，使p40亞基基因在前，p19亞基基因在后，即p40+linker+p19（簡寫為hscIL-23）。將hscIL-23
5、融合基因插入至pMD18-T載體中，經(jīng)基因測序驗證融合基因是否正確。(2)提取pMD18-T-hscIL-23質(zhì)粒DNA，經(jīng)HindⅢ和NheI雙酶切，純化后的酶切產(chǎn)物hscIL-23基因通過T4連接酶與經(jīng)和HindⅢ,NheI雙酶切并純化的pcDNA3.1(+)真核表達質(zhì)粒連接，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hscIL-23，采用同樣的方法構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28a(+)-hscIL-23。(3)將原核表達質(zhì)粒pET28a(+)-hscIL-23轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3+)中
6、，IPTG誘導(dǎo)表達帶有His標(biāo)簽的重組蛋白，采用鎳柱親和層析純化重組蛋白，采用SDS-PAGE電泳和Westernblot分析鑒定表達產(chǎn)物。(4)pcDNA3.1(+)-hscIL-23質(zhì)粒按不同比例通過陽離子聚合物介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Hela細胞，同時設(shè)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，轉(zhuǎn)染48h后分別收集細胞及細胞培養(yǎng)上清。以人IL-23ELISA試劑盒鑒定各組細胞培養(yǎng)上清中hscIL-23融合蛋白的含量，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對，測定各組細胞培養(yǎng)上清中hscIL-23的表達水平。(5)分離人PBM
7、Cs，加入收集的各組細胞培養(yǎng)上清及PHA-P共培養(yǎng)72h，MTT法?本研究受國家自然科學(xué)基金項目（編號:30600518/C030112）資助。1檢測各組人淋巴細胞的增殖水平。結(jié)果：(1)構(gòu)建的pMD18T-hscIL-23質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定，插入片段序列序列與預(yù)期完全一致。構(gòu)建的pcDNA3.1(+)hscIL-23和pet28a(+)-hscIL-23表達質(zhì)粒，其基因測序結(jié)果同樣無改變，p40、p19、linker的連接順序、方向及序列均與預(yù)期相符。(2)原核表達質(zhì)粒pet28a(+)-hscIL
8、-23轉(zhuǎn)化的大腸桿菌可成功表達重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot鑒定，所表達重組融合蛋白（hscIL-23）約為60kd，且能為hscIL-23p19抗體所識別。(3)轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒的Hela細胞中，ELISA檢測Hela細胞在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后培養(yǎng)上清液中hscIL-23蛋白的含量，其中未轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)上清為9.11±11.78pg/ml，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)組的含量為10.47±9.04pg/ml，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-pscIL-12組為254.3
