重組人scr1真核表達載體的構(gòu)建、 表達及其生物學活性的論文

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1、重組人sCR1真核表達載體的構(gòu)建、表達及其生物學活性的論文摘要】目的:采用酵母細胞分泌型載體ppic9k表達人可溶性補體受體（scr1）,研究重組人scr1融合蛋白的體外生物學活性。方法:從人外周血中提取總rna,應用rtpcr獲得人scr1全長cdna,然后將其克隆入畢赤酵母細胞分泌型表達載體ppic9k中,構(gòu)建含人scr1的重組質(zhì)粒（ppic9kscr1）,經(jīng)測序鑒定正確,電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母細胞smd1168中,將經(jīng)g418抗性篩選出的重組scr1酵母細胞株進行pcr鑒定,經(jīng)甲醇誘導,表達產(chǎn)物經(jīng)sdspage分析和d1

2、168細胞表達出重組scr1融合蛋白。此蛋白在sdspage上表現(xiàn)為mr約31000的蛋白區(qū)帶,在ab）識別。經(jīng)ni2+ntaagarose親和層析純化后得到較純的scr1融合蛋白及較高的生物學活性。結(jié)論:人scr1融合蛋白在酵母細胞表達系統(tǒng)中的高水平表達,并且有與人體天然蛋白相同的抗原性及其生物學活性。【關(guān)鍵詞】可溶性補體受體1畢赤酵母細胞生物學活性真核表達載體補體受體1（plementreceptortypel,cr1）又稱c3b/c4b受體,在人白細胞表面被命名為cd35分子,是最早定型的補體受體,也是目前所知最重要

3、的一種補體受體。.an等[1]于1990年首次研制出缺乏跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的可溶性補體受體1（solubleplementreceptortypel,scr1）是cr1細胞外片段。并證明了保留天然cr1已知的所有功能單位,但喪失信號轉(zhuǎn)導作用,用于阻斷人類疾病對補體不適當激活造成的機體組織損傷,對治療和診斷補體介導的自身免疫性疾病、病毒感染、肝病、器官移植排斥反應等疾病中具有廣闊的應用前景和較高的經(jīng)濟效益。因此,運用基因工程方法構(gòu)建真核表達scr1,具有一定的研究和應用價值。畢赤酵母菌（pichiapastoris）是一類常用的基因

4、工程及工業(yè)表達體系,具有高生物菌體產(chǎn)量、強啟動子、高分泌效率、有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工,有利于真核蛋白的表達等優(yōu)點,便于進行高密度培養(yǎng)和放大發(fā)酵規(guī)模。目前人們已利用畢赤酵母系統(tǒng)成功表達了許多外源蛋白[2,3]。為了下一步研究scr1用于補體介導的自身免疫性疾病、病毒感染、肝病、器官移植排斥反應等疾病診斷和治療的可能性,我們從人全血中克隆獲得的全長cdna,并在畢赤酵母中進行了表達和生物學活性鑒定?！　?材料和方法　　1.1材料　　巴斯德畢赤酵母細胞smd1168(pep4△his4)、酵母分泌型表達載體ppic9k由福州總醫(yī)院

5、全軍檢驗中心楊湘越主任技師惠贈;表達于大腸桿菌bl21（de3）中的重組pet28ascr1質(zhì)粒,dh5α為本室保存;rna全血抽提試劑盒購于qiagen公司;逆轉(zhuǎn)錄酶購于promega公司;膠回收試劑盒購自博日科技有限公司;3s柱離心式酵母基因組制備試劑盒購于申能博彩生物科技有限公司;pyrobest高保真dna聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、t4連接酶、dnamarkerdl2000、1000bpdnaladdermarker、蛋白marker、蛋白預染marker均購自takara公司;引物合成及核苷酸序列均由上海英俊生物技

6、術(shù)有限公司和上海生工生物工程技術(shù)有限公司測定;溴化乙錠（eb）、生物素、酵母氮堿（ynb）干粉、d山犁醇等均購自上海生工生物技術(shù)有限公司;ni2+ntaagarose購自qiagen公司;bca法測定蛋白試劑盒購自pierce公司;g418（氨基糖苷類抗菌素）購于太陽馬生物工程有限公司;鼠抗人cd35mab、辣根過氧化物酶（hrp）標記的山羊抗小鼠igg均購于晶美公司;綿羊紅細胞溶血素購于浙江省玉環(huán)縣南方試劑廠;其他所用試劑均為國產(chǎn)或進口分析純;ypd、bmgy、bmmy和md培養(yǎng)基均按invitrogen公司的畢赤酵母菌實

7、驗操作手冊配制;pe2400型dna擴增儀為abi公司產(chǎn)品;電轉(zhuǎn)杯、電擊儀、transblot電轉(zhuǎn)印儀及fluorstmmultilmager凝膠成像系統(tǒng)均為biorad公司產(chǎn)品?！　?.2方法　　1.2.1重組質(zhì)粒ppic9kscr1的構(gòu)建　?。?）擴增scr1基因的引物:5′tctctcgagaaaagagaggctgaagctgccccagatcattttctg3′;下游引物:5′tctgcggccgcctagtgatggtgatggtgatgctcccatttgttcagggc3′。以重組pet28as

8、cr1質(zhì)粒為模板,用pyrobest高保真dna聚合酶擴增所需克隆的目的片段scr1。（2）pcr擴增條件:94℃變性5min;94℃1min;57℃1min;72℃1min,35個循環(huán),最后72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)加eb的瓊脂糖電泳后回收目的條帶。（3）重組質(zhì)粒p