負載脊髓勻漿蛋白的樹突狀細胞促進小鼠脊髓損傷功能恢復的作用

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1、第三軍醫(yī)大學碩士學位論文負載脊髓勻漿蛋白的樹突狀細胞促進小鼠脊髓損傷功能恢復的作用摘要脊髓損傷(spinalcordinjury，sCI)通常導致災難性的神經(jīng)功能缺損，傳統(tǒng)治療方法作用有限。隨著對ScI免疫反應研究的深入，保護性．自身免疫反應在SCI神經(jīng)功能恢復中的作用引起關注。樹突狀細胞(dendriticcells，DCs)是專職抗原提呈細胞(antigenpresentingcells，APC)，在幼稚T細胞的活化、免疫方向的調(diào)控甚至T細胞極性的轉(zhuǎn)換等方面具有重要作用。已經(jīng)證實，損傷局部注射負載髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)或其衍生肽的DCs可以促進

2、SCI后神經(jīng)功能恢復。但MBP成分單一，制各較困難，不利于臨床推廣且作用有限；局部注射需要顯露椎管，操作復雜，損傷大。脊髓勻漿蛋白(homogenateproteinofspinalcord，hp)理論上包含SCI局部所有的可能抗原成分，更為接近體內(nèi)真實環(huán)境，且制備簡單，便于臨床使用；腹腔注射操作簡單，損傷小。本文旨在探討負載脊髓勻漿蛋白的DCs(dendriticcellspulsedwithhomogenateproteinofspinalcord，hpDCs)能否促進SCI神經(jīng)功能恢復以及腹腔注射的效果和局部注射是否有差別。材料與方法1．制作小鼠SCI模型。成年BALB尼小鼠，使

3、用顯微外科動脈夾制作TlO節(jié)段重度鉗夾傷SCI模型。2．制備小鼠未成熟DCs、hp及hpDCs。3．實驗干預及分組。實驗動物分3組，傷后1天，BBB評分<2分者，分別局部或腹腔注射hp(局部：40pg／5止；腹腔：40pg／o．3札)、DCs(局部：1×106cells／5此；腹腔：1×106cells／0．3rIlL)或hpDCs(局部：1×106cells／5“L；腹腔：1×106cells／O．3mL)。4．各動物每周進行BBB評分，觀察神經(jīng)功能恢復情況。5．注射后28、56、84天(dayspostinjection，dpi)，左心室灌注固定后取材，HE染色觀察局部病變情況，測

4、量脊髓損傷區(qū)長度。6．免疫組織化學染色(IHc)與免疫熒光組織化學雙標法觀察損傷后GFAP、Nestin、NF在損傷區(qū)表達情況，測量膠質(zhì)瘢痕厚度。7．脊髓損傷大鼠在84dpi行生物素化葡聚糖胺(biotjnylateddextranamine，BDA)6第三軍醫(yī)大學碩士學位論文軸突順行示蹤，辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)軸突逆行示蹤，結(jié)合IHC檢測膠質(zhì)瘢痕與軸突、囊腔的關系。結(jié)果1．各組小鼠在傷后均出現(xiàn)完全性截癱，1w左右BBB評分逐漸恢復。其中，hpDCs組小鼠恢復最快，于28dpi進入平臺期，BBB評分高達14．O±2．O，最終達到16．3±2

5、．1，顯著高于DCs組(10．0±2．0)和hp組(10．4±1．8)p<0．01)。腹腔注射和局部注射BBB評分結(jié)果無統(tǒng)計學差異。2．HE染色顯示各組損傷局部均出現(xiàn)反應性膠質(zhì)瘢痕增生，空洞形成。但是，hpDCs組損傷局部空洞范圍與DCs、hp組比較具有顯著統(tǒng)計學差異p

6、而其它二組在注射后28dpi基本消失；NF表達可以明確地觀察到損傷后軸突分布的情況，各組無顯著區(qū)別。4．各組中，BDA順行示蹤與HRP逆行示蹤觀察到軸突終止于膠質(zhì)瘢痕外，未到達囊腔內(nèi)。結(jié)論1．本實驗制備的小鼠脊髓鉗夾傷模型，造成脊髓嚴重不完全損傷，其病理過程和臨床接近，能夠模擬臨床自然病程，符合實驗要求。2．局部或腹腔注射hpDCs，能夠顯著促進小鼠SCI神經(jīng)功能恢復，而hp具有相對較弱的促進作用，單純DCs效果最差。3．腹腔注射和局部注射具有同樣效果，表明hpDCs是通過全身性的系統(tǒng)免疫起作用。4．hpDCs可以延緩局部膠質(zhì)瘢痕形成，降低膠質(zhì)瘢痕密度和厚度，縮小局部空洞及損傷部位面積

7、，提示可以降低膠質(zhì)瘢痕對神經(jīng)再生的屏障作用；可以延長局部Nestin表達，提示可以增加局部存在的內(nèi)源性再生能力。5．免疫組織化學熒光雙標技術及神經(jīng)纖維示蹤技術證實hpDCs不能夠使軸突穿過膠質(zhì)瘢痕。6．hpDCs較單純DCs或hp效果好，表明局部DCs效應不足，或者與抗原結(jié)合能力受限。7第三軍醫(yī)大學碩士學位論文綜上所述，本文通過小鼠脊髓鉗夾傷的神經(jīng)功能評價、病理學及免疫學研究，發(fā)現(xiàn)負載脊髓勻漿蛋白的未成熟樹突狀細胞可以促進ScI后神經(jīng)功能恢復，