曲古抑菌素a對t細胞的影響與在大鼠腎臟移植中的應用

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1、博士學位論文曲古抑菌素A對T細胞的影響及在大鼠腎臟移植中的應用博士研究生：魏強指導教師：于立新教授摘要一研究目的：隨著器官移植技術的發(fā)展，我國接受器官移植的患者逐年增多，這些患者術后需長期服用各類免疫抑制劑進行抗排斥治療，盡管這些藥物的作用機理和作用環(huán)節(jié)不盡相同，但都不可避免的具有毒副作用，而且某些免疫抑制劑的治療窗較窄，藥代動力學方面也存在明顯的個體差異，需要密切監(jiān)測藥物濃度，給術后長期治療增加負擔。因此開發(fā)新型的針對性強、副作用小的免疫抑制劑就顯得尤為必要。組蛋白去乙?；敢种苿┠軌蛘{(diào)控組蛋白乙?；ヒ阴；胶鈴亩诨虮?/p>

2、達調(diào)控、DNA復制及修復等過程中起著重要的作用，它參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們研究的目的在于探討曲古抑菌素A這種組蛋白去乙?；敢种苿┯绊慣細胞免疫功能的作用機制，包括對T細胞的活化和增殖這個器官移植的免疫過程的中心環(huán)節(jié)的影響、對免疫應答過程中具有重要意義的IL-2表達的影響，以及對異體大鼠腎臟移植模型中移植腎的影響，為其應用于器官移植領域的免疫治療及誘導免疫耐受提供理論及實驗依據(jù)。二實驗方法：1．不同濃度TSA對小鼠外周血、脾臟T細胞數(shù)量檢測：將40只昆明種小鼠隨機分為5組，各8只。A組(空白對照組)：生理鹽水0．5ml／kg

3、／d皮下注射；B組(CTX簦I)：CTX20mg／kg／d皮下注射；C組(TSA1組)：中文摘要TSA0．4mg／kg／d皮下注射：D組(TSA2組)：TSA0．8mg／kg／d皮下注射；E組(TSA3組)：TSA1．6mg／kg／d皮下注射；處理一周后分別取小鼠外周血及脾臟，其中脾臟制成脾細胞懸液。分離外周血及脾臟淋巴細胞，用a．醋酸萘酯酶染色法觀察實驗小鼠T細胞的數(shù)量變化情況。2．TSA對小鼠外周血、脾臟CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群數(shù)量及比值檢測：同樣取上述方法處理過的外周血和脾臟，分離外周血及脾細胞懸液中淋巴細胞，加入

4、Ratanti-mouseLyt2+及．Ratanti．mouseL3T4+熒光標記小鼠單克隆抗體，流式細胞儀檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群數(shù)量并計算其比值。3．觀察TSA對MLC中淋巴細胞增殖作用的影響分別取BALB／c及C57BLd,鼠脾臟制成單細胞懸液，以淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，調(diào)細胞數(shù)為lxl06個／ml。兩種淋巴細胞1：1混合后加入96孔板，每孔加入上述細胞懸液10011L及0．16、0．8、4、20、100、500nmo兒不同稀釋度的TSA100I．tL，對照組用等體積RPMI．1640培養(yǎng)液代替，分別在作

5、用12h、24h及48h后每孔加入0．5％MTT209L作用4小時，經(jīng)1500rpm離。C,,lOmin，棄上清液，再加入10011LDMSO溶液，用酶標儀于570nm波長下測oD值。每濃度設5個復孔，以未加TSA組細胞作為對照。根據(jù)OD值算出各組細胞抑制率的大小。4．TSA對激活淋巴細胞IL-2表達的影響制備C57BLdx鼠脾臟淋巴細胞懸液，并調(diào)整細胞數(shù)為1×106個／ml作為反應細胞；分離BALB／cdx鼠淋巴細胞，加入絲裂霉素75nmol／L，孵育30min后去除殘余絲裂霉素，調(diào)整細胞數(shù)為1x106個／ml作為刺激細胞。實

6、驗組取反應細胞及刺激細胞各lml，置于細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每組設6個復孔，分別加A．1pmol莫能霉素，放入37‘C，5％的C02孵箱培養(yǎng)，48h后按50l-tL／孔分別加入0。16、0．8、4、20、100、500nmol／L濃度TSA；陽性對照組用CTx代替TSA：陰性對照組使用I沖MI一1640培養(yǎng)液代替TSA。第4天取細胞，用IL-2熒光標記單抗染色后流式細胞儀分別檢測各組熒光值。5．大鼠原位腎臟移植模型的建立H博士學位論文供體手術：取成年雄性Wistar大鼠，戊巴比妥腹腔麻醉后，取腹部正中T型切口，充分暴露左腎、腹主動脈和下

7、腔靜脈。游離左腎并完全游離左腎動靜脈，分別結(jié)扎、切斷左腎動靜脈主干各分支，在左腎動靜脈上方阻斷腹主動脈和下腔靜脈，于左腎動脈下方穿刺腹主動脈并固定穿刺導管，剪開腎靜脈下段下腔靜脈，用4。C的HCA液經(jīng)穿刺導管灌注，至腎臟變灰白，下腔靜脈流出的灌注液清亮為止。游離輸尿管至膀胱，帶腹主動脈及下腔靜脈瓣剪斷腎動靜脈，帶膀胱瓣取下腎臟。置于冰水中迸一步去除腎動、靜脈斷端殘余的脂肪及多余的外膜，從根部切斷腎動靜脈，修剪膀胱，保留輸尿管開口周圍膀胱瓣，供腎置于冰袋中保存?zhèn)溆?。受體腎移植手術：SD大鼠同樣取上述切口，充分游離左腎動、靜脈，在靠

8、近腹主動脈及下腔靜脈根部夾閉左腎動、靜脈，在靠近根部約l／3處切斷左腎動靜脈，沿左腎下極切斷并結(jié)扎左側(cè)輸尿管，摘除左腎。以11．0和9．0無創(chuàng)縫合線間斷端端吻合供受者腎動靜脈，開放血流后將膀胱瓣與受者膀胱做間斷縫合。。6．觀察移植腎的組織病理形態(tài)變化：成功構(gòu)建9