犬瘟熱病毒h基因克隆測序和原核表達

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1、萊陽農(nóng)學(xué)院碩士學(xué)位論文符號說明簡寫CDCDVOPMV符號說明英文全稱caninedistemper中父犬瘟熱caninedistempervirus犬瘟熱病毒0nderstepoon犬瘟熱病毒的常用疫苗株measlesvirus麻疹病毒vemcellAfricallgreenmonkeycell非洲綠猴腎細胞ORFnmDNAcDNARNAELISAPCRRTopenreadingfragment開放閱讀框nanOmeter納米deox蜘bonucleicacid脫氧核糖核酸ComplementaryDNA互補DNAribonucleicacidEn珂ome—linkedimmunosorb

2、entassaypolymerasechainreactionreVerSetranscriptRrr-PCRreVerSetranscriptiVe—PCR0DRNasindNTPAmpKDopticaldensityRibonucleaseInhibitor核糖核酸酶聯(lián)免疫吸附試驗聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)逆轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)吸光度RNA酶抑制劑deoxyribonucleosjdetriphosphate脫氧核糖核苷三磷酸Ampicillin(kilo)Dalton氨芐青霉素(千)道爾頓萊IjI=i農(nóng)學(xué)院碩十學(xué)位論文符號說明bpntULBHRPrpmCPEEDTARNaseTETmEBl

3、PTGbasepairnucleotideunlt堿基對核苷酸單位Luria．BertaniMediumLB培養(yǎng)基Horseradishperroxidase辣根過氧化物酶rOtatlOnpermmutecytopathiceffect轉(zhuǎn)

4、龠細胞病變ethylenediaminetetraacetate乙二胺四乙酸ribonucleasetris／EDllAbufrermeltingtemperatureethidiumbromide核糖核酸酶TE緩沖液熔解(變性)溫度溴化乙錠isopropyl．D．D．thiogalactoside異丙基硫代-D-D一半乳糖苷M(m01／L)mole／1

5、iteoSDSPAGE摩爾濃度sodiumdodecylsulfat十二烷基磺酸鈉P01yacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS—PAGESDs—Pol”crylamidegelsDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳electrOphOresisx．gal5-bromo．4一chloro．3一indoly—p—D唱a15一溴一4一氯一3一吲哚一D—D一半actoside乳糖苷萊陽農(nóng)學(xué)院碩士學(xué)位論文摘要犬瘟熱病毒H基因克隆測序與原核表達摘要1．將犬瘟熱病毒弱毒株接種Vero細胞觀察細胞病變，將細胞反復(fù)凍融三次收獲病毒，并對病毒增殖純化。根據(jù)GenBank中已發(fā)表

6、犬瘟熱病毒Onderstep00rt弱毒株的附著或血凝蛋白基因序列，設(shè)計合成了一對能擴增1074bp基因片段的引物，引物兩端有sall和xhoI酶切位點。以病毒RNA為模板，用RT—PcR方法，擴增出1074bpH基因。將擴增得到的部分H基因克隆到pMDl8一T載體上，經(jīng)藍白斑和酶切鑒定篩選出陽性克隆進行序列測定，用blast工具將其與GeneBank上標(biāo)準(zhǔn)株代表毒株序列進行了比較。結(jié)果表明：該基因與標(biāo)準(zhǔn)株代表毒株序列完全同源，同時與疫苗株Onderstepoort、convac株和國內(nèi)外cDV病毒分離株進行了序列分析和同源性比較。結(jié)果顯示目前使用的cDV弱毒疫苗株H基因的核苷酸和編碼氨基

7、酸與國內(nèi)和日本犬瘟熱病毒分離株同源性比較低，與揚州分離株同源性為90．6％，長春分離株為91．3％，新疆分離株為90．5％，日本分離株D85755為91％；與Onderstepoort、convac株、美國分離株98—2666—2同源性較高，分別為97．7％、97．2％、98．1％，與國內(nèi)、日本分離株存在明顯的差異。上述結(jié)果表明，cDV在傳代過程中由于受生態(tài)環(huán)境、不同動物之間互相傳播等因素的影響，引起了野毒株的變異，cDV疫苗株不能對所有的cDV流行株產(chǎn)生有效的保護。2．對克隆載體pTH做salI和xhoI雙酶切，將所得片段以正確閱讀框架插入pET一32a(+)載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pETH

8、。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定為陽性后，轉(zhuǎn)化八宿主菌zcD，，BL21(DE3)。IPTG誘導(dǎo)表達，經(jīng)sDs—PAGE分析表明，在64KD處出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符目的條帶。確定了最佳誘導(dǎo)表達條件，IPTGl．0】TlM、25℃、Amp濃度100峭／ml、誘導(dǎo)表達6h。經(jīng)western—blot免疫印跡試驗進一步證實，該基因獲得了正確表達。對表達蛋白做可溶性分析，證實該蛋白以沉淀包涵體形式存在，并對包涵體進行純化得到目的蛋白。