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《犬瘟熱病毒n蛋白基因的克隆、原核表達(dá)及其重組蛋白的抗原性研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、犬瘟熱病毒N蛋白基因的克隆、原核表達(dá)及其重組蛋白的抗原性研究摘要犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（Caninedistempervirus，CDV）感染犬或其它食肉目動(dòng)物引起的高傳染性、致死性疾病，以雙相熱、紅疹、結(jié)膜炎、白細(xì)胞減少及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主要特征，為危害特種養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一類重要疾病。因該病沒有特效藥物進(jìn)行治療，所以對(duì)本病的預(yù)防和早期診斷就尤為重要。本研究主要包括以下三部分：1犬瘟熱N蛋白基因的克隆及序列分析參考GenBank中發(fā)表的CDVN蛋白基因序列，用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，從患犬瘟熱的犬全血樣品中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到1572bp的基因片段，將其插入pMD
2、18-T克隆載體中構(gòu)建了pMD18-CDVN重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α中，進(jìn)行鑒定、測(cè)序。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因從起始密碼子ATG開始到終止密碼子TAA結(jié)束全長(zhǎng)為1572個(gè)核苷酸，與GenBank中發(fā)表的CDVN蛋白基因序列相比同源率達(dá)到93.9％-99.1％。2犬瘟熱N蛋白基因的原核表達(dá)及重組蛋白的反應(yīng)原性研究將CDVN蛋白基因與原核表達(dá)載體pGEX-4T-2連接構(gòu)建了pGEX-4T-2-CDVN重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，進(jìn)行鑒定、測(cè)序、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。Westernblot分析顯示表達(dá)產(chǎn)物為84kDa的重組蛋白，可被犬瘟熱抗血清所識(shí)別，具有
3、良好的反應(yīng)原性。3犬瘟熱N蛋白基因原核表達(dá)條件的優(yōu)化、重組蛋白純化及免疫原性研究為了提高GST-CDVN重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性的表達(dá)量，對(duì)GST-CDVN重組蛋白在大腸桿菌中的多種表達(dá)條件進(jìn)行了研究，選擇最佳條件進(jìn)行高效表達(dá)，用GST-Sepharose4B親和層析柱對(duì)GST-CDVN重組蛋白進(jìn)行純化，得到最大量的可溶性重組蛋白。通過免疫小鼠證明了GST-CDVN重組蛋白具有良好的免疫原性。本研究成功克隆、表達(dá)了犬瘟熱N蛋白基因，純化得到了具有很強(qiáng)抗原性的重組蛋白，為建立犬瘟熱ELISA診斷試劑盒提供了可能，為亞單位疫苗的研制提供了依據(jù)?；A(chǔ)關(guān)鍵詞：犬瘟熱病毒；N蛋白基因；克隆；原核表達(dá)
4、；抗原性IIICloningandProkaryoticExpressionofNProteinGeneofCanineDistemperVirusandAntigenicityoftheRecombinantProteinAbstractCaninedistemperisakindofinfectiousandfataldiseasewhichaffectedonthedevelopmentofspecialstraincultivationindustry,causedbycaninedistempervirusinfectingcanineandothercarnivoraanimal.
5、Theclinicalfeaturesarediphasicfever,roseola,conjunctivitis,leucocytopenia,andcentralnervoussystemdamage.Itisparticularlyimportanttopreventandearlydiagnose,becausenowitdoesn’thavespecificmedicinetocure.Thefollowingthreestudieswereconductedinthepresentarticle.1CloningandsequenceanalysisofNproteingeneo
6、fcaninedistempervirusOnepairofthespecialprimersweredesignedbyoligo6.0softwareaccordingtotheNproteingenesequencesofcaninedistempervirus(CDV)publishedinGenBank.A1572bpCDVNproteingenefragmentwasamplifiedbyRT-PCRfromthetotalRNAtemplateinthewholebloodsamplesinfectedbyCDV,anditwasclonedintoapMD18-Tvectort
7、oconstructpMD18-CDVNrecombinationplasmid.SequenceanalysisshowedthatthetotallengthofCDVNproteingenewas1572nucleotidesfromstartcodonATGtostopcodonTAA,andthehomologyofthenucleotidesequencewas93.9%-99.1%c
